زخم معده
اولسر معده به زخمی گفته می شود که در دیواره معده ، ابتدای روده کوچک ، ایجاد می شود.
زخم معده بیماری شایعی است و یکی از علل اصلی آن عفونت باکتریایی است اما برخی زخم ها بواسطه استفاده طولانی مدت از داروهای غیر استروئیدی ضد التهاب مانند آسپرین و ایبوپروفن ایجاد می شوند.
در موارد معدودی تومورهای سرطانی در معده یا پانکراس نیز می توانند باعث ایجاد زخم شوند.
استرس یا خوردن غذاهای تند و ادویه دار زخم معده ایجاد نمی کند اما باعث بدتر شدن آن می شوند.
هلیکوباکتر پایلوری
محققان بر این باورند که این باکتری عامل اصلی ایجاد اکثر زخم های معدی است اما بسیاری از افراد هم در عین آلودگی به آن دچار زخم نمی شوند.
اینکه چرا هلیکو باکتر در برخی افراد زخم معده ایجاد نمی کنند مشخص نیست. به احتمال زیاد نتیجه به ویژگی های فرد آلوده شده ، نوع هلیکوباکتر و سایر فاکتورهایی دارد که تا کنون شناخته نشده اند.
نقش هلیکوباکتر در ایجاد زخم معده
هلیکوباکتر مخاط پوشاننده معده و دئودنوم را ضعیف می کند و به این ترتیب اسید معده به زیر دیواره معده که حساس است راه می یابد. اسید معده و خود باکتری دیواره معده را ملتهب نموده باعث ایجاد زخم می شوند.
مشکلات غالبا شامل موارد زیر است :
هلیکوباکتر پایلوری قادر است در شرایط اسیدی معده زنده بماند زیرا آنزیم هایی ترشح می کند که این اسید را خنثی می کنند. مکانیسم فوق به هلیکوباکتر این امکان را می دهد که به یک ناحیه امن ، لایه مخاطی حفاظت کننده معده ، راه یابد. به محض رسیدن به این قسمت شکل مارپیچ باکتری به آن کمک می کند پنهان شود.
علائم
ناراحتی های شکمی شایع ترین علامت اولسر معده هستند. این مشکلات غالبا شامل موارد زیر است :
. درد آرامی که آزار دهنده است
. چند روز یا چند هفته یکبار عود می کند
. 2 تا 3 ساعت پس از خوردن غذا شروع می شود
. نیمه شب ، زمانی که معده خالی است رخ می دهد
. با خوردن غذا تسکین می یابد
. دیگر نشانه ها شامل کاهش وزن ، کم اشتهایی ، آروغ زدن ، تهوع ، استفراغ هستند.
تشخیص زخم ناشی از هلیکوباکتر پایلوری
برای فهمیدن منشا درد های معده پزشک معمولا عکسبرداری با اشعه ایکس یا انجام اندوسکپی را توصیه می کند
برای عکس برداری بیمار باید مایع گچ مانند سفیدی به نام باریم را بخورد تا قسمت های فوقانی دستگاه گوارش شامل مری ، معده و دئودنوم یا ابتدای روده باریک را شفاف شود .
اندوسکپی بررسی است که برای انجام آن از یک اندوسکپ استفاده می شود. اندوسکپ لوله باریکی است که دوربین کوچکی در انتهای آن قرار دارد .
با مصرف کمی داروی آرامبخش ، بیمار آرامش می یابد و پزشک به دقت اندوسکپ را وارد دهان و از آنجا وارد حلق می کند تا به معده و دئودنوم می رسد.
به این ترتیب پزشک می تواند دیواره مری ، معده و دئودنوم را مشاهده کند ، از زخم های موجود عکس بگیرد و حتی نمونه بسیار کوچکی از بافت معده را گرفته زیر میکروسکپ مشاهده کند.
به این کار بیوپسی گویند. اگر زخمی خونریزی کرده باشد پزشک می تواند با استفاده از اندوسکپ داروهای انعقاد خون را به محل زخم تزریق کرده یا یک پروب حرارتی را به محل منتقل کرده زخم را داغ کند.
تشخیص هلیکوباکتر پایلوری
اگر زخمی تشخیص داده شود ، پزشک ، بیمار را از لحاظ عفونت با هلیکوباکتر پایلوری بررسی می کند. این آزمایش حائز اهمیت است زیرا درمان زخم ایجاد شده در اثر عفونت با هلیکوباکتر پایلوری بادرمان زخم ناشی از مصرف داروهای غیر استروئیدی متفاوت است.
در حال حاضر تشخیص آلودگی هلیکوباکتر پایلوری با آزمایش خون ، تست تنفس ، آزمایش مدفوع و بررسی های بافتی صورت می گیرد.
تست تنفس اوره نیز روش تشخیصی مفیدی است. معمولا از این تست پس از دوره درمان نیز استفاده می کنند تا از حذف کامل باکتری اطمینان حاصل شود. بیمار یک محلول حاوی اوره نشاندار که کربن آزاد می کند ، می نوشد سپس خون این کربن را به ریه ها می رساند و از اینجا بابازدم بیمار خارج می شود. صحت این تست 96 تا 98 درصد است.
آزمایشات بافتی معمولا با استفاده از نمونه بیوپسی که به کمک اندوسکپ گرفته می شود ، به سه صورت انجام می گیرد :
- تست سریع اوره آز که در آن آنزیم اوره آز تولید شده توسط هلیکوباکتر پایلوری تشخیص داده می شود.
- تست بافت شناسی که برای یافتن و بررسی باکتری ها صورت می گیرد.
- تست کشت که مستلزم رشد هلیکوباکتر در نمونه بافت است.
در تشخیص هلیکوباکتر پایلوری ، اغلب آزمایشات خون ، تنفس ، و مدفوع پیش از تست بافت انجام می شوند زیرا غیر تهاجمی تر و آسانتر ند اما آزمایش خون پس از اتمام دروه درمان برای تشخیص موفقیت درمان انجام نمی گیرد به دلیل آنکه خون بیمار پس از درمان نیز ممکن است نتایج مثبت کاذب را نشان دهد.
انتشار میکروارگانیسم ها در هوا و عوامل موثر بر آن
انتشار میکروارگانیسم ها در هوا و عوامل موثر بر آن
ویژگیهای فیزیکی سلول میکروبی : اندازه و شکل ، ناهمواریهای سطحی، وزن مخصوص، بادهای الکتروستاتیکی
ویژگیهای مریوط به هوا : حرکت باد، جابه جایی هوا، لایه بندی هوا، نحوه چرخش هوا، میزان رطوبت و حرارت
وزن مخصوص اسپورها معمولا حدود 1/1 تا2/1 است، بنابرین در هوای ساکن به سرعت رسوب می کنند . پس از شروع حرکت اسپور، سرعت آن بیشتر می شود و سپس به حد ثابتی می رسد .
قانون استاک stock :
رابطه بین اندازه و سرعت نهایی اسپور صاف و گرد در یک محیط را با قانون استاک بیان می کنند . این سرعت نهایی حرکت، به تناسب اندازه اسپور، رطوبت نسبی هوا، خشکی یا ناهمواریهای سطح اسپور تغییر می کنند . اسپورهای غیر کروی در مقایسه با اسپورهای کروی، حرکت کندتری دارند . به هم چسبیدن ذرات و اسپورها موجب کاهش سرعت آنها می شود .
سرعت باد معمولا سرعت نهایی اسپور را حداقل 100 بار بیشتر می کند . گاه سزعت باد باعث می شود تا رسوب اسپورها با اندازه و اشکال مختلف به ثورت مشابه انجام می شود .
انتشار اسپور در هوا به صورت افقی، عمودی و چرخشی می باشد . انتشار افقی نزدیک سطح زمین بیشتر از انتشار عمودی است و این امر به دلیل اثرات حرارت و آشفتگی هوا است .
ذخیره شدن میکروارگانیسم های هوا :
میکروارگانیسم ها پس از رها شدن در هوا، بالاخره به لایه سطحی هوا در سطح زمین یا گیاهان باز می گردند و ذخیره می شوند . ذخیره شدن میکروارگانیسم ها در هوای خشک و در باران، به روش های مختلف انجام می شود :
. ذخیره شدن در هوای خشک : نشست اسپورها در اثر نیروی جاذبه، تنها در هوای ساکن و در سرعت حرکت کم باد انجام می شود و در این شرایط حائز اهمیت است . هر گاه اسپورها وارد لایه هوای ساکن مجاور زمین شوند به سرعت ته نشین می شوند . نشست اسپور می تواند بر سطوح تحتانی و فوقانی برگهای افقی انجام شود . هنگامی که باد به طرف مانعی می وزد ، ذرات ریز و درشت را با خود حمل می کند و پس از برخورد به مانع و بازگشت از آن ذرات درشت تر را برجای می گذارد . از آنجا که اسپورهای بسیاری از میکروبهای بیماریزای گیاهی، مانند فیتوفتورا اینفستانس و پوکسینیا درشت هستند بهتر در ساقه یا برگ گیاه جمع می شوند و اسپورهای کوچک قارچهایی مانند پنسیلیوم سریعتر جابه جا می شوند . تراکم بالای گیاهی در یک منطقه می تواند قسمت اعظم میکروارگانیسم های هوا را در سطح گیاهان ذخیره کند . در یک مزرعه گندم، حدود 70% اسپورهای لیکوپردوم در سطح گیاه گندم و 20% در هوا باقی می ماند . یک بار الکتروستاتیکی مثبت یا منفی در همه اسپورها، از جمله بازیدیوسپورها، اسکوسپورها و سایر اسپورها وجود دارد . این بار که احتمالا برای آزاد شدن اسپورها لازم است، بعد ها با گرفتن یونهای اتمسفر خنثی می شود . ذرات باردار می توانند به وسیله سطوح مختلف جذب یا دفع می شوند.
. ذخیره شدن در باران : قطرات باران می توانند ذرات میکروبی را در خود گرفته و آنها را به طرف زمین حمل کنند . میکروارگانیسم ها می توانند در ذرات و قطرات باران جمع شوند، به وسیله درات ابر گرفته شده یا حتی در مرکز قطره قرار گیرند . میزان ذخیره شدن ذرات در قطرات باران، بستگی به ذره باران و نیز سرعت نهایی قطره باران و ذره میکروبی دارد . هر قدر اندازه اسپورها کوچکتر باشد، امکان جمع شدن آنها با قطرات باران کمتر است . ریزش باران در کاهش تعداد اسپورهای موجود در هوا تاثیر بسزایی دارد .
انواع و تراکم میکروارگانیسم ها در محیط های باز شهری و خارج از شهر و نیز بر حسب تراکم جمعیت، پوشش گیاهی و فعالیت های انسانی متفاوت است . به طور کلی در محیط های شهری، تعداد باکتری ها بیشتر بوده در حالی که در هوای مناطق روستایی، تعداد باکتری ها از چند صد عدد در هر متر مکعب تجاوز نمی کند .
متداول ترین قارچ های هوا دوترومیست ها، کلادوسپوریوم، بازیدیومیست ها، اسپوروبلومیس است و فراوانترین آنها بازیدیومیست ها هستند .
به طور کلی تراکم میکروارگانیسم ها به ویژه اسپورهای قارچی در هوا بر حسب فصل سال، شرایط آب و هوایی، تغییرات درجه حرارت و رطوبت، میزان بارندگی و جریان هوا متفاوت است . تعداد کلی میکروارگانیسم ها در مناطق سرد قطبی بمراتب کمتر از سایر نقاط است چرا که اصولا منبع تولید آنها کمتر است . تعداد میکروبهای هوا به دلیل تغییر نوع فعالیت ها، در اوقات مختلف شبانه روز متفاوت است . بازیدیومیست ها، به ویژه انواع بی رنگ ( مانند اسپروبلومیس) معمولا در شب یافت می شوند ؛ در حالی که تعداد اسپورهای فیتوفتورا در صبح بیشتر بوده و با کاهش رطوبت هوا پس از طلوع آفتاب افزایش می یابد . از آنجا که تشکیل اسپور اریزیف به وسیله نور کنترل می شود، بنابرین در میانه روز کامل شده و به هنگام عصر توسط هوا جابه جا می شود . در هوای مرطوب اسپور آسکومیست ها که برای آزاد شدن، نیاز به مرطوب شدن قبلی دارند، به راحتی آزاد می شوند . باران می تواند در جدا کردن اسپور از منبع آن از طریق شستن و سپس آزاد سازی در هوا دخالت کند .
بسیاری از بیماری های گیاهی به کمک هوا منتقل و منتشر می شوند، بنابرین بررسی و مطالعه میکروبیولوژی هوا در فضای باز می تواند به محدود کردن بیماری های گیاهی کمک کند .
آلودگی هوا با گوگرد منجر به افزایش تعداد میکروبها می شود اما در مقابل وجود ترکیبات و فلزات سنگین در هوا، از جمله گرد و غبار صنایع فلز کاری، در مقیاس کوچک و احتمالا سرب حاصل از دود اتومبیل منجر به کاهش تعداد میکروبها می شود .
همه چیز درباره ی آنتی بیوتیک ها
مقاله ی پیش رو یکی از کامل ترین در زمینه ی آنتی بیوتیک هاست که در آن توضیحات کاملی در رابطه با متابولیسم آنها , طریقه ی سنتز آنتی بیوتیک ها به همراه تصاویر ساختار و ... قرار داده شده که توسطمیکروبیولوژی پزشکی به دو زبان فازسی و انگلیسی برای شما آماده شده و شما میتوانید آنرا به راحتی دانلود کنید . هم چنین نمونه ای از متن این مقاله در زیر آمده است .
"عوامل ضدمیکروبی که از لحاظ بالینی کارایی دارند همگی سمیت انتخابی را علیه باکتری در مقایسه با میزبان نشان می دهند.در واقع این ویژگی است که آنتی بیوتیکها را از مواد ضدعفونی کننده متمایز می کند.اساس انتخاب بسته به نوع آنتی بیوتیک متغیر می باشد.وقتی انتخابی بودن هدف برای یک آنتی بیوتیک بالا باشد،آنتی بیوتیک معمولا" سمی نیست.با این وجود،حتی آنتی بیوتیکهای بسیار انتخابی هم اثرات جانبی دارند."
"Clinically effective antimicrobial agents all exhibit selective toxicity toward the bacterium rather than the host. It is this characteristic that distinguishes antibiotics from disinfectants. The basis for selectivity will vary depending on the particular antibiotic. When selectivity is high the antibiotics are normally not toxic. However, even highly selective antibiotics can have side effects."
محیطهای کشت
محیطهای کشت
محیط های کشت افتراقی برای باکتری گرم منفی :
محیطهای کشت افتراقی تنها به باکتری های گرم منفی اجازه رشد را می دهند و از رشد باکتری گرم مثبت جلوگیری می کنند .
انواع محیط های افتراقی شامل :
. سیمون سیترات آگار
. رد بوراث
. EMB
. IMviC
. TSI
. اوره آز
محیط سیمون سیترات آگار :
این محیط یکی از محیط های افتراقی باکتری گرم منفی است و حاوی منبع کربن سیترات می باشد . رنگ محیط کشت سبز است . تهیه این کشت در لوله های آزمایش و به صورت کج انجام می شود . طرز کشت باکتری در این محیط به صورت زیر می باشد :
. ابتدا فیلدوپلاتین با سر گرد را استریل می کنیم و مقداری باکتری (سراشیا) از محیط کشت برمی داریم .
. فیلدوپلاتین را وارد محیط کشت سیمون سیترات آگار کرده و به صورت مارپیچی روی سطح محیط می کشیم (اسلنت) .
. سپس محیط کشت را به مدت 24 ساعت در حرارت 37 درجه سانتی گراد در انکوباتور قرار می دهیم و بعد نتایج را مشاهده می کنیم :
. اگر باکتری منبع کربن را مصرف نکند محیط سبز رنگ باقی می ماند .
. اگر باکتری منبع کربن را استفاده کند رنگ محیط آبی نفتی می شود .
نتایج و مشاهدات :
باکتری مورد نظر سراشیا بوده و در محیط سیمون سیترات آگار رشد کرده ودر اثر مصرف منبع کربن ایجاد رنگ آبی نفتی در محیط کرده است .
محیط رد بوراث :
این محیط نیز یک محیط افتراقی به شمار می آید که حاوی منبع قند (گلوکز) می باشد . محیط مایع وقرمز رنگ می باشد . در لوله دورهام تهیه می شود . طرز کشت باکتری در این محیط به شرح زیر می باشد :
. ابتدا فیلدوپلاتین با سر گرد را استریل می کنیم و مقداری باکتری از محیط کشت برمی داریم .
. فیلدوپلاتین را وارد محیط رد بوراث می کنیم و فیلدوپلاتین را تکان می دهیم تا باکتری ها در محیط آزاد شوند (تلقیحیی)
. لوله را به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد در انکوباتور قرار داده و بعد نتایج را مشاهده می کنیم :
. اگر باکتری از منبع قند استفاده نکند محیط قرمز رنگ باقی می ماند .
. اگر باکتری از منبع قند استفاده کند :
. تولید اسید (محیط زرد رنگ)
. تولید اسید همراه با گاز(محیط زرد و مشاهده گاز در لوله )
نتایج و مشاهدات :
باکتری سراشیا قند موجود در محیط را تجزیه کرده و محیط را به رنگ زرد در آورده است .
محیط کشت EMB(آئوزین متیلن بلو) :
یک محیط انتخابی – افتراقی حاوی مواد زیر است :
· پروتئین
· بافر
· متیلن بلو
· ائوزین
· کربوهیدرات های سوکروز و لاکتوز
رنگ های ائوزین و متیلن بلو مانع از رشد باکتری های گرم مثبت شده و به باکتری های گرم منفی اجازه رشد می دهند . لاکتوز و ساکاروز منبع کربن اند و باکتری ها بر اساس توانایی تخمیر و عدم تخمیر لاکتوز از هم جدا می شوند . (ساکاروز منبع کربن برای باکتری هایی است که لاکتوز را تخمیر نمی کنند) .
لاکتوز مثبت ها کلنی تیره و لاکتوز منفی ها کلنی شفاف تولید می کنند .
MCA (مک کانکی آگار) :
این محیط ، یک محیط انتخابی – افتراقی است که سبب رشد انتروباکتریاسه و باکتری گرم منفی و افتراق لاکتوز + ها از لاکتوز – ها می شود . حاوی مواد زیر است :
· پروتئین
· نمک صفراوی
· کلرید سدیم
· لاکتوز
· کریستال ویوله
· قرمز خنثی
عمل انتخابی محیط مربوط است به کریستال ویوله و نمک صفراوی که مانع رشد گرم مثبت ها می شوند. آنها که لاکتوز مثبت اند به رنگ قرمز صورتی اند که ناشی از تولید اسید از تخمیر لاکتوز و جذب آن توسط نوترال رد و بدنبال آن تغییر رنگ معرف به قرمز می باشد. لاکتوز منفی ها کلنی بی رنگ ایجاد می کنند
محیط کشت IMviC :
. I : محیط SIM معرف ایندول
. Mvi : محیط های Mr و Vp
. C : سیمون سیترات آگار
کاتالاز
کاتالاز این یک آنزیم عمومی می باشد که در اکثر میکروارگانیسم ها یافت شده است که پراکسید هیدروژن را به آب و اکسیژن تبدیل می کند و کاتالاز دارای عدد Turnover بالایی دارد و دارای ساختار تترامری می باشد که دارای 4 زنجیره پلی پپتیدی 500 اسیدآمینه ای است و شامل 4 گروه پورفیرینی هم می باشد که باعث می شود که با پراکسید هیدروژن واکنش دهد.آنزیم کاتالاز نقش مهمی در فیزیولوژی وبیماریزایی و تعیین هویت باکتریها دارد. باکتریهای هوازی و بی هوازی اختیاری در تنفس هوازی خود به دلیل داشتن دو آنزیم کاتالاز و سوپراکسید دیسموتاز می توانند فشارهای اکسیژن را تحمل کرده و آب اکسیژنه ناشی از زنجیره انتقال الکترون و ناشی از سلولهای فاگوسیستیک را تجزیه نمایند. این آنزیم نه تنها در سم زدایی آب اکسیژنه نقش دارد بلکه امروزه به عنوان یک مارکر اولیه در کنترل آلودگی محیطی در صنایع غذایی و به عنوان یک شاخص حضور باکتریها در مواد غذایی و حتی به عنوان مدرکی دال بر حیات در کره ماه می باشد. کاتالاز واکنش تجزیه پراکسید هیدروژن را کاتالیز نموده و آن را به آب و اکسیژن مولکولی تبدیل می نماید کاتالاز با دو روش این کار را انجام می دهد : 1) روش کاتالازی که در آن دهنده الکترون مولکول پراکسیدهیدروژن دیگری است . 2) روش پراکسیدازی که نیاز به یک دهنده هیدروژن دارد. کاتالاز به 3 گروه زیر تقسیم می شود : 1) کاتالازهای تک عملکردی که بیشتر مطالعات بر روی این می باشد. 2) کاتالازپراکسیداز 3) Mn کاتالاز آنزیم کاتالاز در این میکروارگانیسم ها وجود دارد: استافیلوکوکوس – نایسریا – باسیلوس – کورینه باکتریوم ( در جنس لیستریا برای جداسازی آن از استرپتوکوک بتا همولیتیک استفاده می شود) –بروسلا – هموفیلوس – انتروباکتریاسه – بوردتلا ( البته فقط بوردتلا پاراپرتوزیس و بوردتلا برونچی سپتیکا ) – یرسینیا – لژیونلا – فرانسیلا – پسودوموناس – ویبریو – میکوباکتریوم – اکتینومیست ها ( فقط استرپتومیسس و نوکاردیا ) و اشرشیا کلای تاثیر کاتالاز بر روی بیماریزایی باکتری: همانطور که می دانیم سیستم ایمنی بدن کارایی بالایی در جهت تشخیص مواد با منشا خارجی دارد . میکروارگانیسم های انگل پس از عبور از سدهای پوستی و یا غشاهای مخاطی با 4 سیستم تشخیص ایمنی مواجه می شود : کمپلمان – سلولهای فاگوسیت کننده – آنتی بادی و ایمنی سلولی . هنگامی که بدن برای اولین بار با یک آنتی ژن بیگانه مواجه می شود ‚ پاسخ های ایمنی سلولی و آنتی بادیها پس از گذشت چندین روز بارز می شود ‚ در حالی که کمپلمان و سلولهای فاگوسیت کننده از همان ابتدای برخورد با آنتی ژن وجود داشته و در همان دقایق اول ورود آنتی ژن وارد عمل می شوند . هم چنین عوامل طبیعی ویژه مانند لیزوزیم ‚ اینترفرون و غیره نیز می توانند با ویژگی کم وبیش شبیه آنتی بیوتیک ها در همان لحظات اولیه برخورد بدن با آنتی ژن بیگانه وارد عمل شوند. سلولهای فاگوسیت کننده مثل نوتروفیل و ماکروفاژها برای برخورد با این عوامل خارجی تولید یکسری مواد می کنند کهدر زیر توضیح داده شده است. آنزیم کاتالازی که در پاسخ به ایمن مواد تولید شده توسط فاگوسیت کننده ها داده می شود در واقع مکانیزمی برای زنده ماند باکتری می باشد و به همین دلیل است که در بیماریزایی آن نقش دارد. ازجمله باکتریها: استافیلوکوکوس اورئوس: در اثر ورود باکتری به داخل بدن نوتروفیل و ماکروفاژهای بدن در اثر برخورد با آنتی ژن ورودی که همان باکتری است فعال شده اکسیژن مولکولی را به گونه های واکنشگر اکسیژن (Reactive Oxygen Species) یا (ROS) تبدیل می کنند این مواد عوامل اکسید کننده بسیار فعالی هستند که میکروبها و سایر سلولها را از بین می برند. سیستم اصلی مولد رادیکالهای آزاد، سیستم فاگوسیت اکسیداز است. فاگوسیت اکسیداز، آنزیمی با زیرواحدهای متعدد است که در فاگوسیت ها فعال شده و عمدتا در غشای فاگولیزوزوم ساخته می شود.فاگوسیت اکسیداز به وسیله محرک های متعدد القا و فعال می شود از جمله به وسیله IFNᵧ و پیام های که از TLRها می رسندعملکرد این آنزیم احیای اکسیژن مولکولی به ROS (نظیر رادیکالهای سوپراکسید) است، و شکل احیا شده نیکوتین آمید آدنین دی نوکلئوتید فسفات (NADPH) نیز به عنوان کوفاکتور این واکنش عمل می کند. این آنزیم با انتقال الکترون از مولکول اکسیژن باعث تولید آنیون سوپراکسید می شود این مولکول در آخرین اوربیتال خود یک الکترون جفت نشده دارد. این سوپراکسید تولید شده تمایل دارد اوربیتال خود را دوتایی کند در نتیجه به هر ماده ای که برسد آن ماده را اکسید کرده و یک الکترون از آن می گیردو همچنین این سوپراکسید که اوربیتال خالی دارد می تواند در یک واکنش آنزیمی با هیدروژن ترکیب شده و به پراکسید هیدروژن تبدیل شود که پراکسید هیدروژن رادیکال هیدروکسیل را آزاد می کند که مسئول اثر اکسیدکنندگی آن بر روی لیپیدهای غشاء و مولکول DNA و دیگر اجزای سلول می باشد در غلظت های پایین مولکول DNA را می شکند و این باعث می شود که ژن آنزیم کاتالاز که در باکتریها وجود دارد فعال شده و آنزیم کاتالاز توسط ریبوزوم های سیتوپلاسمی باکتریها به صورت آپوکاتالاز تولید شده و بعد با 4 گروه هم ترکیب می شود و به صورت کاتالاز در می آید و در پاسخ به آب اکسیژنه تولید می شود. هم چنین آنزیم دیگری به نام میلوپراکسیداز از پراکسید هیدروژن استفاده می کند تا یون های هالید (HOCL) را که در شرایط طبیعی غیرفعال هستند به اسیدهای واکنشگر هیپوهالوس که برای باکتری سمی هستند تبدیل کند. فرآیندی که طی آن ROSها تولید می شوند انفجار تنفسی نامیده می شود. در اینجا باکتری می تواند ترکیب آب اکسیژنه را با آنزیم کاتالاز که خود تولید می کند به مولکول آب و اکسیژن تبدیل کند و وقتی باکتری بتواند این کار را انجام بدهد پس اینطوری میتواند در برابر عوامل فاگوسیت کننده از خود مقاومت نشان دهند پس اینگونه می توانند سریعا گسترش پیدا کنند و به همین دلیل است که کاتالاز با عفونت زایی باکتری رابطه دارد. این مکانیزم در دیگر باکتریها هم دیده می شود. نایسریا گونورآ (Neisseria Gonorrhoeae): یکی از مهم ترین دفاع های این باکتری علیه نوتروفیل های انسانی کاتالاز می باشد. نوتروفیلها دارای NADPH اکسیداز هستند که این آنزیم یک الکترون به اکسیژن مولکولی انتقال داده و باعث تولید آنیون سوپر اکسید می شود که این با آب ترکیب شده و تولید آب اکسیژنه می کند که باکتری با داشتن کاتالاز می تواند آن را ازبین برده و انتشار یابد. کمپیلوباکترها (Campylobacter): ژن کد کننده کاتالاز در اینها Kat A می باشد وکاتالاز به عنوان یک ماده ضروری برای مقاومت و رشد این باکتریها می باشد که در این هم واکنش به صورت مثالهای قبل می باشد. سالمونلا تیفی موریوم: در این باکتری 3 نوع آنزیم کاتالاز دیده می شود: 1. KATE & KATG که کاتالاز هستند وبرای فعالیت خود به آهن نیاز دارند. 2. KATN که برای فعالیت خود به Mn نیاز دارد. با این حال اگرچه KATN برای ایفای نقش در بیماریزایی آزمایش نشده است ولی یک ارتباط بین بیان ژن KATN و افزایش مقاومت به پراکسید در سالمونلا تیفی موریوم وجود دارد. تعدادی از نقشهای که Mn ممکن است در بیماریزایی بازی کند: 1. نقش در دفاع بر ضد استرس یا تنش های اکسایشی 2. نقش آن به عنوان کوفاکتور برای فعالیت آنزیم های دخیل در متابولیسم سلول و مسیر signaling 3. تاثیر آن در بیان ژن بیماریزایی کشتهایی از مایکوباکتریوم توبرکلوزیس حرارت داده شده در 68 درجه سانتی گراد به مدت 20 دقیقه قادر به تولید کاتالاز نمی باشند. غیر بیماریزا ها تحت اثر حرارت قرار نگرفته و به تولید کاتالاز ادامه می دهند. مشاهده شده است که گونه های بیماریزای مایکوباکتریوم توانایی تولید کاتالاز را ندارند و هم چنین به ایزونیازید مقاوم هستند. توالی کد کننده کاتالاز توسط یک پروتئین 486 اسیدآمینه ای کد می شود.ژن کاتالاز با کدون TTG که 987 کدون بوده شروع شده و با TAA که 2445 کدون می باشد به پایان می رسد. اشرشیا کلای دارای 2 نوع آنزیم کاتالاز بوده که به نام های زیر می باشد : HPI &HPII که اولی 81 کیلودالتون بوده و دومی 93 کیلو دالتون که اولی تترامر و دومی هگزامر می باشد و هردو توسط ژن KATG کد می شود. ژن KATE که کد کننده آنزیم کاتالاز در باکتری Bacillus Megaterium می باشد. تست کاتالاز: اصول کار: آنزیم کاتالاز پراکسید هیدروژن را به آب و اکسیژن می شکند اگر مقادیر کمی از ارگانیسم های تولید کننده این آنزیم را با آب اکسیژنه مجاور نمایند بلافاصله حباب های اکسیژن آزاد می شوند. روش انجام آزمایش: با استفاده از لوپ ویا یک تکه چوب مقدار کمی از کشت خالص را به سطح لام خشک و تمیز منتقل می کنیم . بلافاصله یک قطره از پراکسید هیدروژن 3% را بر روی بخشی از کلنی های سطح لام می ریزیم .از نظر آزاد شدن حباب های گاز بررسی می کنیم. آزاد شدن حبابهای گاز نشان دهنده وجود آنزیم کاتالاز در میکروارگانیسم است که آب اکسیژنه را به آب و اکسیژن شکسته می شود. استافیلوکوک ها کاتالاز مثبت هستند و مقدار زیادی حباب های گاز اکسیژن تولید می کنند و استرپتو کوک ها کاتالاز منفی می باشند و هیچ حباب گازی را تولید نمی کنند. توصیه می شود که تست کاتالاز بر روی کلنی هایی انجام شود که در محیط های فاقد خون رشد کرده باشند گلبول های قرمز مقداری آنزیم کاتالاز دارند که واکنش ضعیفی را در تست کاتالاز مقداری از محیط آگار حاوی گلبول قرمز را در نقطه مجزایی از سطح لام می گذارند و آب اکسیژنه را به آن اضافه می کنند. اگر واکنش تست کاتالاز به طور قابل توجهی قوی تر از واکنش در محل آگار حاوی گلبول قرمز باشد تست کاتالاز مثبت در نظر گرفته می شود.
الکتروفورز :
روش رنگ امیزی باکتریهای گرم مثبت وگرم منفی
معروفترین نوع رنگ آمیزی مرکب نوع گرم می باشد . این روش مفیدترین روش تشخیص باکتریها می باشد.میکروبشناسی بنام کریتستیان گرم در سال 1884 بطور تصادفی واکنشی را کشف کرد که بعدها واکنش رنگ آمیزی گرم نامیده شد.
بر این اساس باکتریها با توجه با ساختمان دیواره یاخته ای (سلولی) به دو بخش بزرگ و کلی تقسیم می شوند: باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی . تفاوت عمده بین این دو گروه تفاوتهای ساختاری(ساختمانی) بین این دو گونه می باشد به این ترتیب که در گونه گرم مثبتها در دیواره سلولی نوعی پلی ساکارید بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی ضخیمتر می باشد در صورتیکه در دیواره سلولی نوع گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته و دیواره سلولی آن کمی نازکتر از نوع گرم منفی می باشد.
بر همین اساس در رنگ آمیزی گرم با توجه به این تفاوت مهم در دیواره سلولی ، از دو نوع رنگ استفاده می شود ، رنگ اولیه کریستال ویوله می باشد . هنگامیکه محلول کریستال ویوله به گسترش باکتریایی اضافه می شود این رنگ با ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی ترکیب شده و کمپلکس کریستال ویوله – ریبونوکلئات را بوجود می آورد و بعد از شستشوی رنگ اضافی ، محلول ید را بکار می برند . این محلول ید که ترکیبی فلزی می باشد به رنگ متصل شده و یک ترکیب رنگی غیر محلول ایجاد می کند بنام کمپلکس کریستال ویوله –ید که در سر دیگر آن متصل شده به ریبونوکلئات موجود در دیواره سلولی و تشکیل کریستال ویوله – ید – ریبونوکلئات داده است در حالیکه در باکتریهای گرم منفی چنین کمپلکسی ایجاد نمی شود. این پیوند در باکتریهای گرم مثبت بسیار پایدار است و در مرجله بعدی توسط ماده رنگ بر شکسته نمی شود و رنگ بنفش کریستال ویوله را در خود حفظ کرده بنابراین باکتریهای گرم مثبت زیر میکروسکوپ بنفش رنگ دیده می شوند.
از طرفی در دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی مقدار چربی بیشتری بکار رفته است بنابراین چربیها در الکل استن که در مرحله بعدی بعنوان رنگ بر بکار می روند ، محلول هستند و در اثر این واکنش چربیها از دیواره سلولی خارج شده و در اثر شستشو با حلال رنگ بر ، رنگ کریستال ویوله هم از سطح باکتری خارج می شود . با خروج چربی توسط ماده رنگ بر ، بر اندازه منافذ دیواره سلولی افزوده شده که این امر باعث بی رنگ شدن سریع باکتریهای گرم منفی می شود .در این مرحله باکتریهای گرم منفی از کریستال ویوله پاک می شوند . بنابراین بعد از شستشو توسط آب و افزوده شدن رنگ دوم یعنی سافرانین (فوشین) ، این رنگ به دیواره سلولی باکتریهای گرم منفی جذب شده و باکتریها به رنگ قرمز در می آیند و در بررسی میکروسکوپی ، باکتریهای گرم منفی برنگ قرمز دیده می شوند.
اکثر باکتریهای موجود ، گرم منفی هستند البته بعضی از باکتریها ، مخمرها و تعدادی از کپکها گرم مثبت هستند.
بنابراین مراحل رنگ آمیزی گرم را می توان به شرح زیر بیان نمود:
1- تهیه گسترش روی لام : ابتدا از نمونه باکتری یک گسترش روی لام تهیه می کنید.
2- رنگ آمیزی با کریستال ویوله : در این مرحله مقداری از رنگ کریستال ویوله را با قطره چکان به روی سطح گسترش میکروبی روی لام بریزید و بگذارید 1 دقیقه بماند تا رنگ در دیواره سلولی میکروبها نفوذ کند.
3- مرحله شستشو: پس از سپری شدن مدت زمان 1 دقیقه ، رنگ اضافی روی لام را خالی کرده و با استفاده از آب مقطر سطح روی گسترش را شستشو دهید.
4- مرحله اضافه کردن محلول ید : جند قطره از محلول ید را روی گسترش پخش نموده و بگذارید بمدت 1 دقیقه به همان حالت بماند . بعد محلول اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.
5- مرحله رنگ بری با استفاده از استن – الکل : لام را با زاویه 45 درجه نگهدارید بعد با استفاده از محلول رنگ بر الکل – استن که بر روی گستره می ریزید بسرعت آنرا بی رنگ کنید. دقت کنید مرحله بی رنگ سازی بیش از اندازه نباشد. بعد از آن لام را بسرعت بشوئید . این عمل ، بی رنگ شده را متوقف خواهد کرد.
6- رنگ آمیزی با سافرانین : در این مرحله سطح گسترش را با رنگ ثانویه یعنی سافرانین بپوشانید و 30 تا 60 ثانیه صبر کنید . بعد از آن رنگ اضافی را خالی کرده و با آب مقطر لام را شستشو دهید.
7- لام رنگ آمیزی شده را آهسته روی کاغذ خشک کن قرار دهید ولی کاغذ را روی گسترش نکشید.
نکات مهم :
1- حرارت بیش از اندازه هنگام تثبیت گسترش باعث پاره شدن دیواره سلولی باکتری شده . بنابراین باکتری گرم مثبت رنگ اولیه (کریستال ویوله) را هنگام رنگ بری از دست می دهد و رنگ ثانویه را جذب می نماید و در نتیجه باکتری گرم مثبت ، بصورت گرم منفی دیده می شود.
2- اگر گسترش ضخیم باشد هنگام مرحله بی رنگ شدن ، ممکن است مانند یم گسترش معمولی رنگ نشود و این مسئله باعث خطا در تشخیص شما در گرم منفی یا مثبت بودن باکتری خواهد شد.
3- غلظت درست و تازه بودن رنگها هم در رنگ آمیزی موثر است .
4- رنگ بری بیش از حد ممکن است باعت پاره شدن جدار باکتریهای گرم مثبت شده در نتیجه این باکتریها رنگ کریستال ویوله خود را از دست داده و رنگ ثانویه را جذب می نماید و بصورت گرم منفی دیده می شود.
5- دقت شود هنگام تهیه گسترش روی لام از محیط کشت ، سن کشت باکتری باید 24 ساعت یا کمتر باشد . بنابراین در محیط کشتهایی که از عمر آنها گذشته و کهنه شده اند ، در قابلیت نفوذ دیواره سلولی باکتریها تغییراتی حاصل می شود که خاصیت گرم مثبت بودن را از دست می دهد.
در رنگ آمیزی گرم مثبت باکتریها را به 5 گروه تقسیم بندی می کنند:
1- میله ای (باسیل ) گرم مثبت 2- میله ای گرم منفی 3- کوکوس (گرد) گرم مثبت 4- کوکوس گرم منفی 5- باکتریهای بدون واکنش به رنگ آمیزی گرم.
در این رنگ آمیزی می توان هر باکتری ناشناخته ای را در یکی از این 5 گروه قرار داده و با اطمینان 4 گروه دیگر را حذف کرد و به مطالعه در مورد آن باکتری پرداخت .
خصوصیات باکتریهای گرم مثبت و گرم منفی :
1- باکتریهای گرم مثبت نسبت به پنی سیلین و مواد ضد باکتریایی حساستر از گرم منفی ها هستند.
2- گرم مثبت بودن یک باکتری خصوصیتی است که براحتی از بین می رود اما گرم منفی بودن تحت هیچ شرایطی از بین نمی رود . پس هنگام تشخیص و رنگ آمیزی باید به این نکته هم توجه داشت . یعنی در لامهای رنگ آمیزی شده گرم متبت ، باکتریهای گرم منفی هم دیده می شود اما در لامهای گرم منفی از یک کشت خالص هرگز باکتریهای گرم مثبت دیده نمی شوند.
3- باکتریهای گرم منفی سخت رشد ترند یعنی نیاز غذایی آنها پیچیده تر است .
4- باکتریهای گرم منفی نسبت به مواد اسیدی و قلیایی قوی و آنزیم لیزوزیم حساسترند. همه اینها موجب پاره شدن دیواره سلولی این باکتری و هضم و متلاشی شده آن می شوند.
طرز تهیه رنگها و محلولهای گرم :
1- کریستال ویوله :
- کریستال ویوله 2 گرم
- اتانول 95% 20سی سی
- اگزالات آمونیوم(خالص) 8/.گرم
- آب مقطر 80سی سی
کریستال ویوله را در اتانول حل کنید. اگزالات آمونیوم را در آب حل کنیدو سپس دو محلول را روی هم ریخته و بخوبی مخلوط کنید.
2- محلول ید:
- ید 1 گرم
- یدور پتاسیم 2 گرم
- آب مقطر 300 سی سی
ید و یدور پتاسیم را با هم در هاون بسائید تا کاملا نرم شود . مقدار کمی آب اضافه کنید تا محتویات هاون شسته شود. بقیه آب را هم اضافه کرده و کاملا مخلوط کنید . این محلول را باید در شیشه تیره رنگ نگداری کنید.
3- محلول سافرانین :
- سافرانین 25 گرم
- اتانول 95% 10سی سی
- آب مقطر 100سی سی
سافرانین را در اتانول حل کنید . آب مقطر را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را از کاغذ صافی عبور دهید.
4- محلول استن – الکل :
- اتانول 95% 70 سی سی
- استن 30سی سی
دو محلول را کاملا با هم مخلوط کنید.
انواع روشهای رنگ آمیزی
| رنگ آمیزی |
برای رنگ آمیزی باکتریها ابتدا نیاز به تهیه یک گسترش میکروبی از باکتری مورد نظر دارید برای این کار اعمال زیر را انجام دهید. طرز تهیه گسترش میکروبی روی لام : ابتدا یک لام تمیز را برداشته و یک قطره آب مقطر روی آن بریزید بعد در شرایط استریل با استفاده از نوک آنس که آنرا توسط شعله استریل نموده اید، مقداری از پرگنه باکتری را در کنار شعله از روی محیط کشت برداشته و آنرا در یک قطره آب تا حدود 4/1سطح لام پخش کنید . در محیطهای مایع دیگر نیاز به قطره آب نمی باشد . شما می توانید با آنس نوک گرد یک لوپ یا بیشتر از باکتری رشد کرده در محیط مایع را برداشته و آنرا روی سطح لام پخش کنید. بعد بگذارید لام در مجاورت جریان هوا خشک شود . بعد از خشک شدن نوبت به تثبیت گسترش روی لام می شود که این عمل توسط حرارت صورت می گیرد یعنی لام را چند بار از روی حرارت شعله عبور دهید تا گسترش میکروبی روی لام تثبیت شده و در جریان رنگ آمیزی از روی لام کنده نشود.
انواع رنگ آمیزی میکروارگانیسمها 1- رنگ آمیزی ساده : در این روش رنگ آمیزی فقط مورفولوژی (شکل ظاهری ) باکتریها مشخص می شودو باکتریها یکرنگ دیده می شوند و چون یک نوع رنگ در این رنگ آمیزی استفاده می شود آن را ساده می نامند. از این نوع رنگ آمیزی می توان به رنگ آمیزی متیلن بلو به روش لوفلر اشاره نمود.
روش رنگ آمیزی ساده متیلن بلو: ابتدا یک گسترش از باکتری مورد نظر تهیه کرده بعد از طی کردن مراحل مربوط به تهیه گسترش ، لام چند قطره از محلول رنگی متیلن بلو را روی گسترش ریخته و بگذارید رنگ بمدت 1 دقیقه با گسترش واکنش دهد . بعد گستره رنگ شده را با پنس گرفته و لام را بحالت مورب نگه دارید تا باقی مانده رنگها به داخل تشتک یا ظرف رنگ آمیزی بریزد . در همین حالت رنگهای اضافی را با آب مقطر بشویید. لام را به آرامی با کاغذ خشک کن پاک کنید تا آب آن گرفته شود . هیچگاه کاغذ خشک کن را روی گستره نکشید زیرا باعث پاک شده یا از بین رفتن آن می شود. دقت کنید در طی این مدت رنگ آمیزی ، رنگ روی گسترش خشک نشود چون در این حالت رنگ خشک شده متبلور شده و سطح باکتری را می پوشاند و آنرا غیر قابل روئیت می کند . جهت جلوگیری از این حالت تبلور باید از مقدار کافی محلول رنگی استفاده کرده و بعد از خالی کردن آن ، سطح لام را بلافاصله بشوئید. طرز تهیه محلول رنگی متیلن بلو5/0%: - کلرور آبی متیلن بلو5/0گرم - آب مقطر 100سی سی آبی متیلن را در آب مقطر حل کنید.
2- رنگ آمیزی مرکب در این نوع رنگ آمیزی ازدو نوع رنگ استفاده می شود که دارای مراحل مختلفی می باشد . در این نوع رنگ آمیزی که در واقع یک نوع رنگ آمیزی افتراقی می باشد از یک محیط کشت باکتری مجهول ، گسترش تهیه کرده و با شیوه های خاص آنرا رنگ آمیزی نموده و با بررسی میکروسکوپی آن و انجام تستهای اختصاصی دیگر می توان نوع باکتری و بیماریزا بودن آنرا تشخیص داد. از انواع رنگ آمیزی مرکب می توان نمونه های زیر را نام برد: 1- رنگ آمیزی گرم – برای تشخیص نوع باکتری از لحاظ گرم مثیت و گرم منفی بودن آن . 2- رنگ آمیزی اسید فاست زیل – نیلسون – بطور اختصاصی جهت رنگ آمیزی و تشخیص جنس مایکوباکتریوم و بعضی از گونه های جنس نوکاردیا که هر دو بیماریزا هستند ، می باشد. مایکوباکتریوم توبرکلوزیس عامل بیماری سل درانسان و مایکوباکتریوم لپرا عامل بیماری هانسن یا جذام است . 3- رنگ آمیزی کپسول |
پروبیوتیک ها و کاهش سرطان...!
پروبیوتیک ها مکمل های غذایی هستند که بر میزبان تاثیرات سودمندی دارند و به تعادل فلور میکروبی روده کمک می کنند. از مهم ترین پروبیوتیک ها می توان به لاکتوباسیلوس ها و بیفیدوباکتریوم ها اشاره کرد. لاکتو باسیلوسها گرم مثبت ، فاقد اسپور ، کاتالاز منفی و متعلق به خانوادهlactobacillaceae می باشند و تقریبا 56 گونه از این باکتری مورد شناسایی قرار گرفته است.
این باکتری ها جزء فلور نرمال روده ، دستگاه تناسلی زنان و دهان می باشند. و همچنین در مواد لبنی ، گوشت و سطح برگ گیاهان نیز یافت می شوند. محیط کشت اختصاصی برای لاکتوباسیلوس ها محیط MRS است. جنس بیفیدوباکتریوم از فراوانترین گونه هایی است که فلور طبیعی روده بزرگ انسان را تشکیل می دهد و حدود 25% باکتری های مدفوعی بزرگسالان و 80% باکتری های مدفوعی کودکان بیفیدوباکتریوم است.
این باکتری غیر متحرک و غیر اسپور دار و کاتالاز منفی است. و این جنس داری 30 گونه است. آلودگی مواد غذایی و محیط از مهم ترین مشکلات بشر و عامل بیماریهای عمده ای از جمله سرطان است. سرطان یکی از مهم ترین عوامل مرگ و میر در جوامع به شمار می رود که عوامل متعددی از جمله شیمیایی ، پرتوی ، ویروسی و توارث در آن نقش دارند هر عملی که سبب حذف ، مهار و غیر فعال سازی مواد موتاسیون زای ایجاد کننده سرطان شود ارزشمند است .
به طور کلی مکانیسم هایی که باکتری های پروبیوتیک برای کاهش مواد موتاسیون زا و سرطان زا به کار می گیرند کاملا شناخته شده نیست. برخی از آنها عبارتند از : 1). اتصال به ماده موتاسیون زا و جلوگیری از جذب آنها توسط بدن و تجزیه برخی ترکیبات موتاسیون زا : El-Nezami در بررسی خود به این نتیجه رسید که لاکتوباسیلوس رامنسوس در شرایط In vitro توانایی اتصال به آفلاتوکسین را دارد. لاکتوباسیلوس ها و بیفیدوباکتریوم ها توانایی تجزیه ترکیبات N- نیتروز آمینی که در مواد غذایی نیز یافت می شوند و از عوامل مهم سرطان به حساب می آیند را دارند.
Zangو همکارانش نیز مشاهده کردند که باکتری های اسید لاکتیک با اتصال به موتاژن Trp-p-1 ، جذب این ماده را در روده کاهش می دهند. 2). کاهش فعالیت برخی آنزیم های مضر و مهار باکتری های مضر روده : آنزیم های مدفوعی مانند نیتروردوکتاز، آزوردوکتاز ، β- گلوکورونیداز ،گلیکولیک اسید هیدرولاز ، قادرند ترکیبات پیش جهش زا و پیش سرطان زا را به ترکیبات جهش زا و سرطان زا تبدیل کنند. این آنزیم ها در مواد غذایی توسط باکتری های مضر روده تولید می شوند و ثابت شده است که کاهش این آنزیم های مضر که رابطه مستقیمی با کاهش باکتری های مضر دارد ، ریسک ابتلا به سرطان را کاهش می دهد.
طی بررسی Goldin و همکارانش گزارشاتی حاکی بر توانایی لاکتوباسیلوس کاز ه ای در کاهش فعالیت سه آنزیم مضر β- گلوکورونیداز ، نیتروردوکتاز ، آزوردوکتاز بدست آمد و همچنین توانایی دسته ای از این باکتری ها در کاهش این آنزیم ها توسطLing نیز به اثبات رسیده است. 3). تولید متابولیت های ویژه و کاهش اسید های صفراوی: باکتری های پروبیوتیک برخی متابولیت از جمله بوتیرات ، فولات و ... تولید می کنند .که با اثر بر روی سلول های اپیتلیال روده تکثیر سلول های سرطانی را کاهش می دهند.
در بررسی Biffi و همکارانش تولید متابولیت ها توسط باکتری های پروبیوتیک باجلوگیری از تکثیر سلول های سرطانی ارتباط داشت. همچنین این باکتری ها با تولید فولات که برای ترمیم و همانند سازی DNA ضروری است سبب کاهش سرطان می شوند چربی نیز عاملی برای افزایش ابتلا به سرطان روده است.
مصرف باکتری های پروبیوتیک به دلیل عملکرد آنها در کاهش اسید های صفراوی محلول می تواند در کاهش سرطان کمک کند. 4). تحریک سیستم ایمنی: سلول های باکتری های پروبیوتیک قادرند سبب تحریک و تقویت سیتم ایمنی و افزایش میزان سیتوکین ها نظیر TNF-α ، IL-1β شوند . و عاملی برای ممانعت از رشد تومور و کاهش سرطان باشند. طی بررسی Sekine و همکارانش اثرات مثبت بیفیدوباکتریوم اینفتیس در تحریک سیستم ایمنی در موش در مهار مواد موتاسیون زا مشاهده شد.
( PCR ( polymerase chain reaction چیست ؟
تاریخچه :
این تکنِِیک در اواسط دهه ی 1980 بوسیله ی کری مولیس معرفی شد . به دلیل کاربردها و مزیت های بسیار زیاد آن به سرعت در زیست شناسی مولکولی گسترش پیدا کرد . امروزه این روش تقریباً در تمامی آزمایشگاهها ی زیست مولکولی جزو کارهای متداول می باشد و به صورت اتوماتیک بوسیله ی کامپیوتر انجام می شود.
این تکنیک تمامی مشکلات قبلی در زیست مولکولی که ناشی از عدم دسترسی به مقادیر زیاد از
DNA یکسان بود را برطرف کرد . برای مثال قبلاً برای بدست آوردن نسخه های متعدد از یک ژن خاص
می بایست این
ژن را به داخل حامل مناسب وارد کرده و در یک باکتری تکثیر کنند ولی امروزه این کار را به سادگی و با استفاده از PCR انجام می دهند.
PCR از نظر اصول عملی تشابه زیادی به همانند سازی DNA دارد و در واقع برگرفته از آن است . یاد آوری می شود که DNA پلیمراز DNA تک رشته ای را از جهت
5َ 3َ به عنوان الگو مورد استفاده قرار می دهد ورشته مکمل را در جهت 3َ 5َ
می سازد . همچنین DNA پلیمراز برای شروع احتیاج به یک قطعه اولیه ( شناساگر ) دارد .
برای انجام PCR ، DNA پلیمراز ، نوکلئوتید تری فسفات ها و پرایمر لازم هستند . از آنجائیکه DNA دو رشته ای است ، دو نوع پرایمر در PCR مورد نیاز است . این دو پرایمر دو عمل انجام می دهند ، اول
اینکه محل ژنی که باید تکثیر شود را مشخص می نمایند و دوم اینکه اندازه ی قطعات تکثیر شونده
را تعیین می کنند . عمل اول کاملاَ مشخص است ، در مورد عمل دوم باید گفت که وقتی این دو
شناساگر به دو ناحیه ی مختلف DNA و به سمت هم قرار می گیرند DNA پلیمراز تنها قطعات را
در بین این دو ناحیه همانند سازی می کند و به این ترتیب طول قطعات ساخته شده تعیین می شود .
برای شروع PCR ، DNA الگو ، پرایمر ها و نوکلئوتید تری فسفات ها و DNA پلیمراز در یک لوله با هم مخلوط می شوند . سپس لوله را گرم می کنند تا دو رشته DNA از هم جدا شوند . سپس لوله را
سرد می کنند تا پرایمر ها به نواحی مورد نظر متصل شوند و DNA پلیمراز شروع به همانند سازی
از روی DNA بنماید . بعد از مدت زمان لازم برای همانند سازی بار دیگر پرایمر ها به نواحی مکمل
خود متصل شوند . چون در مرحله ی قبل رشته DNA در ناحیه مورد نظر مضاعف شده است ، در این مرحله چهار رشته ی الگو برای همانند سازی وجود دارد و در نتیجه در پایان این مرحله بوجود می آید
، و در مرحله ی بعد 16 نسخه و به همین صورت بطور تصاعدی تعداد نسخه های ژن ها زیاد می شود .
در ابتدای طراحی PCR از آنزیم DNA پلیمراز E.coli استفاده شد ولی این آنزیم به حرارت حساس
می باشد و بنابراین پس از هر بار حرارت دادن محیط واکنش تا دمای 94 درجه ی سانتی گراد ،
افزودن دوباره ی آنزیم تازه به محیط لازم بود . یکی از مهم ترین کشفیات در این زمینه این بود که باکتریهای چشمه های آب گرم دارای DNA پلیمراز هایی هستند که نسبت به حرارت مقاوم بوده و
حتی در دمای بالا فعالیت بهتری دارند . برای مثال باکتری Thermus aquaticus دارای DNA پلیمرازی است که در دمای 94 درجه ی سانتی گراد کاملاَ پایدار است و همچنین دمای اپتیمم عمل آن نیز 72 درجه ی سانتی گراد می باشد ، این DNA پلیمراز که بطور خلاصه Taq پلیمراز نامیده می شود باعث شد که براحتی PCR به صورت اتوماتیک انجام شود و با افزودن یکبار آنزیم Taq پلیمراز دیگر نیازی به اضافه کردن مجدد آن نباشد .
مزیت بسیار مهم دیگر Taq پلیمراز افزایش حساسیت و دقت PCR می باشد . در دمای پایین
( 30 درجه سانتی گراد ) ( که برای DNA پلیمراز E.coli بکار می رفت ) پرایمر ها ممکن است به جایگاههایی که توالی تا حدودی مشابه دارند نیز متصل شوند ، زیرا در دمای پایین تعداد کمتری
پیوند هیدروژنی برای اتصال پرایمر ها نیاز است . بنابراین پرایمر ها با اتصال به نواحی نسبتاَ
مشابه ، باعث ایجاد اشتباه در انجام مراحل PCR می شوند . ولی وقتی که واکنش در دمای 72
درجه ( دمای اپتیمم فعالیت Taq پلیمراز ) انجام شود اتصال پرایمر ها به نواحی غیر از ناحِیه ی
اصلی کاهش می یابد . به این صورت پس از پایان PCR رشته های DNA کاملاَ مشابه و خالص
بدست خواهد آمد .
برای دیدن قطعات تکثیر شده DNA می توان براحتی از الکتروفورز برای ژل آگاروز و رنگامیزی اتیدیوم بروماید استفاده کرد .
· کاربردهای PCR :
تکنیک PCR کاربردهای نا محدودی در عرصه های مختلف زیست مولکولی دارد ، علت اصلی این
امر این است که DNA الگوی بکار رفته در PCR را می توان از منابع مختلف تامین کرده و مورد
استفاده قرار داد .
بطور کلی PCR به دو منظور اصلی بکار می رود :
1 – تهیه ی نسخه های متعدد از یک ژن
2 – بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در یک قطعه DNA
· تهیه ی نسخه های متعدد از یک ژن :
برای این کار بجای اینکه هر دو پرایمر مورد نیاز برای PCR را به یک میزان به محیط واکنش اضافه کنند ، یکی از پرایمر ها را به تعداد کمتر پرایمر دیگر را به تعداد بیشتر اضافه می کنند . در هنگام انجام PCR ،
در ابتدا هر دو رشته با هم همانند سازی می کنند ولی پس از تمام شدن یکی از پرایمر ها فقط
رشته دیگر که هنوز پرایمر آن وجود دارد ساخته می شود و به همین دلیل نسخه های بیشتری از این رشته بوجود می آید. پس از پایان PCR چند نسخه DNA دو رشته ای از ژن مورد نظر ایجاد خواهد
شد که می توان به طور مستقیم در روش سانجر بکار برد .
مثال دیگری از کاربردهای PCR بررسی پیوستگی ژنها و تعیین فاصله ی بین ژنها بر روی کروموزومهای انسان است . در ژنتیک برای تعیین فاصله ی بین ژنها از بررسی تعداد نوترکیبها به نسبت فنوتیپ
والدین استفاده می شود . این روش برای مگس سرکه که زادآوری آن در هر نسل بسیار زیاد و دوره ی رشد آن نیز کوتاه است به راحتی قابل انجام است ولی در مورد انسان که زاده های آن در هر نسل بسیار محدود و با فاصله ی زمانی زیاد می باشد ، این بررسی هابه سختی و با محدودیت بسیار
انجام می گیرد . ولی امروزه دانشمندان با استفاده از PCR روش جدیدی را برای این کار پیدا کرده اند . برای این کار از بررسی آللهای موجود در یک اسپرم استفاده می شود . از آنجائیکه اسپرمها هاپلوئید بوده و در هر اسپرم از هر کروموزوم یک عدد وجود دارد ، با بررسی همزمان دو ژن بر روی یک
کروموزوم و تعیین میزان نوترکیبی بین این دو ژن می توان فاصله ی ژنتیکی بین دو ژن را تعیین کرد .
در واقع از نظر ژنتیکی بررسی 1000 اسپرم با بررسی 1000 فرزند یک خانواده برابر است .
با استفاده از این روش ثابت شده است که میزان نوترکیبی کروموزومها در مردها با میزان نوترکیبی در زنها متفاوت است .
· بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن خاص در مخلوطی از DNA :
به جرات می توان گفت که این کاربرد دوم PCR مهمترین کاربرد آن و علت اصلی
گسترش روزافزون آن در کلیه ی شاخه های علوم زیست مولکولی است .
تعدادی از این کاربردها عبارتند از :
الف ) تشخیص قبل از تولد بیماریهای ژنتیکی :
در این روش تعدادی از سلولهای جنین را استخراج کرده و با پرایمر اختصاصی برای یک ژن بیماری
مجاور می کنند ، همچنین بطور جداگانه با پرایمر ژن سالم نیز مجاور می کنند و PCR انجام می دهند . پس از پایان PCR تفسیر آزمایش چنین خواهد بود : اگر در هردو لوله سنتز DNA انجام شود ،
جنین یک ژن سالم و یک ژن بیمار دارد یعنی حامل است ولی بیمار نیست . اگر سنتز DNA فقط در
لوله ای که شناساگر مخصوص ژن بیمار وجود دارد انجام شود جنین بیمار است و باید سقط شود .
اگر سنتز DNA فقط در لوله ای که حاوی شناساگر ژن سالم است انجام شود ، جنین کاملاَ سالم است
امروزه بسیاری از بیماریهای ژنتیکی مانند هموفیلی ، کم خونی داسی شکل ، سیستیک فیبروزیز
(Cystic Fibrosis ) ، تالاسمی ، سندرم لش – نیهان ، دیستروفی عضلانی دوشن ، فاویسم ، فنیل کتون اوری و غیره را می توان به کمک PCR تشخیص داد.
ب ) تعیین جنسیت جنین :
برای این کار تعدادی از تخمک های زن را خارج می کنند و در شرایط آزمایشگاهی با اسپرمها آمیزش
می دهند و هر یک از سلولهای تخم تشکیل شده را بطور جداگانه کشت می دهند تا اینکه جنین به مرحله ی 10 سلولی برسد . سپس از هر جنین یک سلول را جدا کرده و همراه با پرایمرهای
اختصاصی برای کروموزوم y در لوله PCR وارد می کنند.سپس PCR و در پایان الکتروفورز انجام می شود . در هر یک از لوله ها که جنین نر ( یعنی کروموزوم y ) وجود داشته باشد ، سنتز DNA صورت می گیرد و در لوله ی دیگر نه . حال جنسیت تمامی جنین ها مشخص می باشد و می توان به اختیار خود پسر یا دختر را انتخاب کرده و جنین مورد نطر را به مادر انتقال داد . امروزه تکنیک فوق علاوه بر تعیین جنسیت برای خانواده هایی که در معرض خطر بیماریهای وابسطه به X ( مانند هموفیلی ) هستند نیز استفاده می شود . به این صورت که جنین ها ی اولیه را از نظر وجود ژن بیمار با استفاده از پرایمر اختصاصی آن مورد بررسی قرار می دهند و جنین سالم را به مادر منتقل می کنند .
شاید باورنکردنی باشد که تمامی مراحل بالا یعنی استخراج تخمک از مادر ، لقاح ، تکثیر ، PCR و انتقال مجدد به مادر در مدت زمان یک روز قابل انجام است .
راه دیگر تعیین جنسیت جنین استفاده از خون مادر است . در طی دوران بارداری مقداری از سلولهای جنین وارد خون مادر می شوند . حال اگر PCR برای قطعه ی DYZl ( در حدود 5000 نسخه از این قطعه بر روی کروموزوم y قرار دارد ) بر روی خون مادر انجام شود و جواب مثبت باشد چون مادر کروموزوم
y ندارد پس این ژن مربوط به کروموزوم y جنین است و جنس جنین نر تعیین می شود .
· بررسی عفونت های باکتریایی و ویروسی :
هم اکنون در بعضی از آزمایشگاهها از PCR برای تشخیص ایدز استفاده می کنند. برای این کار از خون محیطی نمونه گیری می کنند و از توالی های اختصاصی ویروس HIV نیز به عنوان شناساگر استفاده
می کنند ، سنتز DNA نشان دهنده ی عفونت ایدز است.
استفاده دیگر PCR در تشخیص بیماری سل می باشد . مایکوباکتریوم توبرکلوزیس یک باکتری بسیار
کند رشد است و رشد معمولی آن در آزمایشگاه حدود 20 روز طول می کشد. در PCR بیماری سل از نمونه ی خلط فرد بیمار به همراه پرایمرهایی که برای توالی خاص مایکوباکتریومهای مکمل می باشند ، مورد استفاده قرار می گیرد . پس از انجام PCR قطعات DNA بدست آمده در مجاورت شناساگرهای اختصاصی برای سوشهای مختلف مایکوباکتریومها قرار می گیرد و به این صورت گونه و سوش آن تشخیص داده می شود .
· تشخیص جهش ها و سرطان ها :
در هر سلول معمولاَ از یک ژن فقط یک نسخه وجود دارد ، و در صورتی که این ژن دچار جهش شود بررسی این جهش بسیار مشکل خواهد بود ، زیرا در سلولهای انسان پیدا کردن یک ژن در میان کل ژنوم انسان ، همانند پیدا کردن سوزن در انبار کاه خواهد بود و پس از پیدا کردن ژن جهش یافته نیز به دلیل محدودیت نسخه های این ژن بررسی کمیت و کیفیت جهش در آن مشکل خواد بود .
ولی امروزه PCR کار را بسیار راحت نموده است . کافی است که یک سالم و یک سلول جهش یافته بطور جداگانه برای یک ژن خاص تحت PCR قرار گیرند و محصولات حاصل با هم مقایسه شوند . به این ترتیب به راحتی می توان محل جهش ، نوع جهش و هر نوع اطلاعات لازم دیگر را به دست آورد .
استفاده دیگر PCR در بررسی مراحل درمانی سرطان می باشد . داروهای مورد استفاده در درمان سرطان داروهای سیتوتوکسیک می باشد که عوارض جانبی بسیار زیادی به همراه دارند. به همین دلیل نیز سرطان شناسان مایل اند که از مراحل بهبودی سرطان اطلاع داشته باشند تا به محض از بین رفتن سلول بدخیم درمان را متوقف نمایند ، ولی در صورتی که بهبودی کامل حاصل نشده باشد ، احتمال عود مجدد بیماری وجود خواهد داشت. با استفاده از PCR دقت تعیین سلولهای سرطانی بسیار بالا می رود که اهمیت آن ناگفته پیداست و به همین دلیل PCR منفی را می توان به معنای بهبودی کامل در نظر گرفت .
· تعیین توالیهای کروموزومی انسان در سلولهای هیبریدی ( هتروکاریونها ) :
یکی از تکنیکهای بررسی ژنوم انسان ، تلفیق ( هیبرید کردن ) هسته های سلولهای انسانی با سلولهای حیوانات دیگر مثلاَ موش است . پس از انجام تلفیق دو هسته ، کروموزومهای انسان به تدریج حذف می شوند ، تا اینکه نهایتاَ یک کروموزوم در درون هسته هیبریدی باقی می ماند . حال گاهی به منظور بررسی های بیشتر لازم می شود که این قسمتهای ژنوم انسان تکثیر شوند ، مثلاَ وقتی که یک ژن خاص مورد بررسی قرار می گیرد . برای این کار ازنوع خاصی از PCR که به Alu-PCR معروف است استفاده می شود.
در این روش از پرایمرهایی استفاده می شود که مکمل توالیهای بسیار تکراری ژنوم ها می باشد ، این توالی های 300 جفت بازی که گاهی تا 900000 بار در ژنوم انسان و دیگر پستانداران تکرار می شود را تکرارهای Alu می نامند . این توالی ها بسیار متغیر می باشند ولی در انسان قسمتی از این توالی ها اختصاصی و ثابت است و به همین دلیل به راحتی می توان از آن برای تکثیر قطعات DNA که بین دو تکرار توالی Alu قرار دارند استفاده کرد . سپس این DNA را می توان خارج نمود و از نظر نوع پروتئین مورد سنتز و یا تعیین توالی و غیره مورد بررسی قرار داد . مهمترین استفاده روش فوق تعیین مکان ژنتیکی ژنهای مختلف برروی کروموزومهای انسان است که تا قبل از این روش تقریباَ نا ممکن ویا بسیار مشکل بود .
· مشکلات PCR :
با تمامی مزیت های فوق PCR مشکلات خاص خود را دارد . مهمترین مشکل PCR آلودگی نمونه های مورد بررسی است . به دلیل حساسیت فوق العاده و قدرت تکثیر زیاد PCR هر قطعه DNA خارجی که وارد محیطPCR شود ، مورد تکثیر قرار گرفته و نتایج عجیب و دور از واقعیتی به وجود خواهد آورد . برای مثال در مورد تحقیقی که در تعیین جنسیت با استفاده از خون مادران باردار بیان شد ، در بین جوابها یک مورد مثبت کاذب برای یکی از زنان غیر باردار که به عنوان شاهد منفی استفاده شده بود ، وجود داشت . پس از بررسی معلوم شد که تعداد ناچیزی از سلولهای پوست یکی از کارکنان مرد آزمایشگاه وارد لوله ی PCRشده است . گاهی نیز باقیمانده ی قطعات DNA حاصل از تکثیر DNA های قبلی باعث آلودگی PCR می شود که در این مورد شستشوی زیاد و دقیق مشکل گشا است .
واکنش زنجیره ی پلیمراز نسخه برداری معکوس : RT-PCR
واکنش زنجیره پلیمراز نسخه برداری معکوس ( RT-PCR ) تعدیلی از واکنش زنجیره پلیمراز PCR ) ) برای تقویت اطلاعات محتوی اسید ریبو نوکلئیک (RNA ) توسط تبدیل آن به DNA و سپس تقویت آن می باشد . رشته ی RNA در ابتدا به صورت معکوس به مکمل DNA خود یا DNA مکمل نسخه برداری می شود و با تقویت DNA حاصله با استفاده از واکنش زنجیره پلیمراز دنبال می گردد . این می تواند یک فرآیند 1 یا 2 مرحله ای باشد .
واکنش زنجیره پلیمراز خودش فرآیندی است که برای تقویت نمونه های DNA بکار می رود ، از طریق پلیمرازDNA با واسطه ی حرارت .
PCR نسخه برداری معکوس نباید با واکنش زنجیره پلیمراز زمان واقعی که غالباَ به صورت RT-PCR خرید و فروش می شود ، اشتباه شود .