اهمیت توجه به آلودگی میکروبی

در این جلسه و جلسات بعد به ادامه مبحث Microbial Limit Test می­پردازیم که منظور از آن آزمایشاتی است که برای کنترل فرآورده­های غیر استریل صورت می­گیرد. اما ابتدا بهتر است با اهمیت آلودگی میکروبی آشنا شویم.

اهمیت توجه به آلودگی میکروبی

در بین سال­های 1959 تا 1979 تحقیقی انجام شد که در آن فرآورده­های دارویی را به چند دسته مائی، ژلی، روغنی، خشک و اسپریت (حاوی الکل) تقسیم کردند و درصد آلودگی آنها را بررسی کردند. نتایج بدین صوت بود:

مائی 35%    ژلی 34%        روغنی26%      خشک  33%    اسپریت 3%

از آنجایی که ممکن بود همه فرآورده­های الوده مشکل­زا نباشند، فرآورده­های با count میکروبی بالا (بیشتر از 10⁵ را انتخاب کردند و در نتیجه نتایج به صورت زیر تغییر کرد:

مائی 22%    ژلی 15%        روغنی10%      خشک  7%      اسپریت 3%

نتیجه­ای که از این تحقیق گرفته شد این بود که میزان آلودگی میکروبی رابطه مستقیمی با میزان آب فرآورده دارد و هرچقدر فرآورده آب بیشتری دارد بیشتر مستعد آلودگی میکروبی می­باشد و باید دقت بیشتری در نگهداری آن شود.

  در ادامه این تحقیق آلوده­کننده­ها را شناسایی و جداسازی کردند که نتیجه آن به ترتیب زیر بود (از راست به چپ):

Pseudomonas aeroginosa، سایر Pseudomona ها، E.coli، S.aureus،  Enterobacter spp، Klebsiella spp،  Proteus spp

همانطور که مشخص است اکثر این باکتری­ها g(-) هستند که باکتری­های آب­دوست می­باشند.

در واقع بعد از این تحقیقات و رخ دادن چند اتفاق (مثل ایجاد بیماری عفونی یکسان در بیماران مصرف­کننده قرص­های تیروئید در کشور سوئد) آزمایشات کنترل میکروبی به فارماکوپه­ها اضافه شد.

آلودگی میکروبی می­تواند 2 خطر عمده ایجاد کند:

1-    به خطر انداختن سلامتی مصرف­کننده با ایجاد عفونت

2-    فساد و ناپایداری فرآورده

این 2 خطر ممکن است با هم و یا تک­تک رخ دهد که بروز هر یک به عوامل متفاوتی بستگی دارد.

فاکتورهای تأثیرگذار بر ریسک ایجاد عفونت در مصرف کننده:

    نوع میکروارگانیسم آلوده کننده؛ که دو حالت دارد، یا میکروارگانیسم بیماری­زاست و یا فرصت­طلب. از پاتوژن­ها می­توان به سالمونلا یا کلستریدیوم اشاره کرد که با تعداد کم نیز قادر به ایجاد بیماری هستند ولی سودوموناس­ها به عنوان فرصت­طلب شناخته می­شوند.

    دوز آلوده کننده؛ منظور از آن مقدار میکروبی است که در طی مصرف دارو وارد بدن می­شود. مثلاًS.aureus که عمدتاً عفونت­های پوستی ایجاد می­کند برای اینکه بتواند روی یک پوست سالم ایجاد عفونت کند به حداقل 10⁶ باکتری نیازمند است در حالیکه برای ایجاد همان عفونت روی پوست ناسالم 10² باکتری کافی است.

    مقاومت سیستم ایمنی بدن میزبان در برابر عامل عفونت؛ E.coli یا Salmonella که عمدتاً عفونت­های گوارشی ایجاد می­کنند برای اینکه بتوانند در یک فرد سالم ایجاد عفونت کند به حداقل 10⁷باکتری نیازمند است در حالیکه برای ایجاد همان عفونت در فرد ضعیف ناسالم 10² باکتری کافی است.

    نحوه مصرف دارو (راه مصرف)؛ پرخطرترین راه مصرف برای انتقال میکروارگانیسم راه تزریقی است چونکه از تمامی سدها رد شده و وارد محیط استریل بدن شده است. بعد از آن به ترتیب فرآورده­های مخاطی، پوستی و خوراکی خطر دارند. خوراکی کمترین خطر را دارد چون میکروارگانیسم باید با اسید معده، آنزیم­ها و ... روبرو شود.

آلودگی میکروبی می­تواند با ترشح یک سری آنزیم و مصرف مواد درون فرآورده به عنوان منبع غذایی تأثیرات متفاوتی بر فرآورده بگذارد مثل:

    تخریب مواد مؤثره

    تخریب مواد افزودنی؛ مثل امولسیفایرها که ممکن است سبب جدا شدن آب و روغن فرآورده شود.

    تخریب مواد نگهدارنده؛ برخی از مواد نگهدارنده به pH حساس هستند و میکروارگانیسم­ها با فعالیت متابولیک خود می­توانند سبب تغییر pH شوند علاوه بر این بعضی میکروارگانیسم­ها با ایجاد تغییراتی در خود از مواد نگهدارنده که خاصیت آنتی­بیوتیکی دارند به عنوان ماده غذایی استفاده می­کنند! این موضوع در مورد ساولن بسیار شایع است چون در طیف اثر خود gap دارد.

    تغییر pH یا تخمیر؛ یکی از نشانه­های آن ایجاد بوی ترش و اسید آلی است.

* در فرآورده­هایی مثل کرم در اعماق ظرف حالت بی­هوازی ایجاد می­شود که سبب رشد میکروارگانیسم­های بی­هوازی و تخمیر و تولید اسید آلی توسط آنها می­شود. امروزه کارخانه­های معتبر به این فرآورده­ها مواد معطر نمی­زنند تا در صورت بروز این اتفاق بوی ترش به راحتی قابل استشمام باشد و مصرف­کننده فرآورده آلوده را مصرف نکند.

    تغییر رنگ و بو؛ به علت واکنش­هایی مثل اکسیداسیون و احیا است که میکروارگانیسم­ها در طی روندهای متابولیک خود باعث آنها می­شوند.

یکی از نکات مهمی که باید به آن توجه کرد این است که آلودگی میکروبی یک فرآیند Static نیست بلکهDynamic و پویا می­باشد.

برای درک بهتر جمله بالا بهتر است با مفهوم Water Activity (A_w) آشنا شوید.

A_W نشاندهنده مقدار آب آزاد (قابل استفاده) است و با Water Content یا محتوای آب متفاوت است چون محتوای آب نشانه میزان کل آبی است که در فرآورده وجود دارد. هر چه فرآورده مولکول­های هیدروفیل و جاذب آب بیشتری مثل نمک­ها و قندها داشته باشد مقدار آب آزاد و در دسترس آن و در نتیجه  A_W کاهش می­یابد.

* میکروارگانیسم­ها توانایی استفاده از آب باند شده را ندارند و فقط می­توانند از آب آزاد استفاده کنند.

اگر 2 فرآورده با Water Content یکسان را در نظر بگیرد که یکی حاوی مقداری قند است ولی دیگری مولکول هیدروفیل خاصی ندارد، فرآورده حاوی قند A_W کمتری دارد. هر چه A_W فرآورده کمتر باشد، فشار بخار آن نیز کمتر است. از همین موضوع برای بدست آوردن A_W استفاده می­شود.

بیشترین مقداری که می­تواند برای این رابطه بدست آید، یک است؛ معمولاً اگر فرآورده A_W بین 6/0 تا 75/0 داشته باشد به عنوان یک فرآورده خشک (Low Water Activity) شناخته می­شود و آب آزاد کافی برای رشد میکروارگانیسم­ها را ندارد. ابلته کم کردن A_W تا این حدود کار آسانی نیست.

در شرایط خشک (اسموتیک)، قارچ­ها (مخمر و کپک) قابلیت رشد دارند. پس از رشد مخمرها، مخمرها برای رشد قند فرآورده را مصرف می­کنند و در نتیجه آب آزاد فرآورده افزایش پیدا می­کند و شرایط رشد برای باکتری­هایg(+) فراهم می­شود که بر اثر مصرف بیشتر مواد غذایی توسط آنها باز هم A_W افزایش پیدا کرده و شرایط برای رشد باکتری­های g(-) مهیا می­شود. به همین دلیل است که گفته می­شود آلودگی میکروبی یک فرآیند دینامیک است.

پس از اینکه اهمیت و خطرات آلودگی میکروبی مشخص شد، یک سری استانداردها و روش­ها برای آلودگی میکروبی وارد فارماکوپه­ها شد.

فرآورده­های دارویی از نظر آلودگی میکروبی به دو دسته عمده استریل (سترون) و غیر استریل تقسیم می­شوند. آزمایشات و استادنداردهای فرآورده­های استریل در مبحث sterility مطرح خواهد شد ولی در مورد فرآورده­های غیر استریل در مبحث Microbial Limit Test یا محدودیت­های میکروبی باید صحبت کرد.

Microbial Limit Test

فرآورده­های غیر استریل شامل فرآورده­های خوراکی، موضعی، پوستی و اکثر فرآورده­های Nasal می­باشد.

آلودگی میکروبی یک فرآورده غیر استریل را باید از 2 جنبه (یکی از این دو یا هر دو) بررسی کرد:

1-   Total Viable Count (TVC) (شمارش کلی میکروارگانیسم­های زنده) که البته در اکثر موارد دارویی منظور از آن شمارش کلی میکروارگانیسم­های هوازی زنده (Total Aerobic Viable Count (TAVC)) است چون در فرآورده­های دارویی خیلی با میکروارگانیسم­های بی­هوازی سر و کار نداریم. این شمارش خود مجموعه 2 شمارش TBC (شمارش کلی باکتری­های زنده) و TYMC (شمارش کلی مخمرها و کپک­های زنده) می­باشد (TAVC = TBC + TYMC). واحد این شمارش   است.

2-   در کنار وجود یک حد (limit) برای تعداد میکروارگانیسم­ها، عدم وجود بعضی میکروارگانیسم­های ویژه (در اینجا میکروارگانیسم­های پاتوژن) باید اثبات شود.

حد مجاز برای وجود میکروارگانیسم (total limit count) را نوع فرآورده و قانونگذار (کشور تابعه) مشخص می­کند که به صورت normal بین 100 تا 1000  است. در ایران برای فرآورده­های سنتتیک این حد را 100 تعریف کرده­اند که 10% این تعداد می­تواند کپک یا مخمر باشد.

برای فرآورده­های گیاهی این حد متفاوت است که در جلسه بعدی توضیح داده خواهد شد.

نکته قابل ذکر این است که آزمایشگاه کنترل میکروبی جزء آزمایشگاه­های روتین در کنترل کیفیت صنایع دارویی به حساب می­آید و آزمایشات Microbial Limit Test روی هر batch تولید شده باید صورت گیرد.

در ایران وجود 5 میکروارگانیسم به طور کلی برای تمامی فرآورده­های غیر استریل ممنوع و غیر مجاز است:

E.coli, S.aureus, P.aeroginosa, Salmonella spp, Candida albicans

وجود کاندیدا در این لیست، مختص ایران است و در بسیاری کشورها در این دسته قرار نمی­گیرد.

در سایر کشورها این میکروارگانیسم­ها بر اساس پارامترهایی مشخص می­شود و مثل ایران همیشه این 5 میکروارگانیسم نیست و تغییر می­کند؛ این پارامترها عبارتند از:

-         منشأ مواد اولیه؛ فرآورده­های با منشأ طبیعی (گیاه، خاک و ...) مستعد آلودگی با Salmonella sppهستند پس بررسی عدم وجود Salmonella spp در این فرآورده­ها الزامی است و باید بررسی شود.

-         راه مصرف فرآورده؛ برای فرآورده­های خوراکی عدم وجود E.coli حتماً باید بررسی شود. در مورد فرآورده­های موضعی S.aureus, P.aeroginosa نباید وجود داشته باشند و در فرآورده­های واژینال و رکتال وجود مخمرها و کپک­ها ممنوع است.

-         جمعیت هدف فرآورده؛ در مورد فرآورده­هایی که برای افراد خاص مثل افراد تحت شیمی­درمانی یا نوزادان (به طور کلی افراد با نقص سیستم ایمنی) حساسیت بالا می­رود و وجود میکروارگانیسم­های ساده­ای مثل باسیلوس­ها که در هوا وجود دارند نیز باید بررسی گردد.

FDA یک سری از میکروارگانیسم­ها را Indicator می­نامد و آنها را به 3 دسته تقسیم می­کند:

1- Harmful؛ خود میکروارگانیسم یا toxin آنها حتماً موجب بیماری یا عفونت می­شود. میکروارگانیسم­های شایع این دسته Salmonella spp و clostridium spp هستند که به اینها Essential pathogen هم گفته می­شود.

2- Objectionable (قابل اعتراض)؛ این میکروارگانیسم­ها در بعضی شرایط ایجاد بیماری می­کنند و یا در بعضی شرایط موجب فساد فرآورده می­شوند. از جمله این میکروارگانیسم­ها می­توان به P.putida اشاره کرد.

3- Opportunistic؛ در افراد با نقص سیستم ایمنی مشکل­زا هستند. در این دسته افراد حتی میکروفلور مفید هم می­تواند مشکل­زا باشد در نتیجه این دسته شامل بسیاری از میکروارگانیسم­ها می­شود.

آلودگی­های میکروبی را در صنایع داروسازی (Microbial Spoilage of Pharmaceutical Products) به چند مرحله تقسیم می­کنند.

1- Primary Contamination

آلودگی­های اولیه به علت آلودگی مواد اولیه (Raw Material) اتفاق می­افتد و سبب آلودگی فرآورده می­شود. از این مواد اولیه می­توان به چند مورد مهمتر اشاره کرد:

- آب؛ برای تولید، فرمولاسیون، شستشو و ... استفاده می­شود.

- محلول­هایی که در شرایط خوبی تهیه نشده­اند و محافظت ضد میکروبی برای آنها صورت نگرفته مثل عرق نعنا که حتی خودش اثر ضد قارچی دارد.

* آب و محلول­های مائی معمولاً با g(-)ها مثل سودوموناس آلوده می­شوند.

- حلال­های آلی و الکل­ها می­تواند با اسپور باکتری­ها آلوده شود.

- پودرهای خشک و مواد بسته­بندی می­تواند با اسپور باکتری­های g(+) و کپک­ها آلوده باشد.

2- Production Contamination

آلودگی در محیط تولید که در آن وسایلی (facilities) که برای ساخت استفاده می­شود بسیار مهم است و همچنین محیط که شامل در، دیوار، کف و هوای محیط می­شود.

سطوح خشک با کوکسی و باسیل g(+) و اسپورها، سطوح مرطوب با باسیل­های g(-) و هوا با اسپور کپک­ها و باکتری­ها می­توانند آلوده باشند.

در یک مطالعه مشخص شد که میزان ریزش پوسته­های بدن در حدود 10000 پوسته در هر دقیقه است! و میکروب­ها هم که به صورت سوار بر ذرات جابجا می­شوند پس بر هرکدام از این پوسته­ها میکروفلور طبیعی بدن نیز سوار است به علاوه اگر فرد بیمار باشد، میکروب­های پاتوژن نیز بر پوسته سوار است. پس لباس مناسب افراد در محیط کا ر بسیار بر بار میکروبی فرآورده مؤثر خواهد بود.

3- Secondary Contamination

در آلودگی ثانویه فرآورده در حین مصرف آلوده می­شود.

در طی آزمایشی یک فرآورده یکسان به تعدادی داروخانه در سطح شهر سفارش داده شد و آلودگی میکروبی آن در زمان تحویل گرفتن از داروخانه و همچنین پس از 2 هفته قرار داشتن در دمای محیط از نظر TVC وPathogen Count مورد بررسی قرار گرفت. نتایج بدین صورت بود که تمامی نمونه­ها پس از تحویل، TVCپایین­تر از 100 داشتند که قابل قبول بود ولی پاتوژن­ها با این درصدها یافت شد:

E.coli  9%, S.aureus  77%, P.aeroginosa  4%, Candida albicans  45%

بعد از دو هفته حدود 36% نمونه­ها TVC بالای 100 داشتند که نشان­دهنده قدرت تکثیر میکروب­ها در این فرآورده است. درصد پاتوژن­ها نیز افزایش پیدا کرده بود که در واقع به این دلیل بوده که در ابتدا آنقدر تعدادشان کم بوده که قابل شناسایی نبوده­اند ولی پس از 2 هفته با تقسیمات تعدادشان زیاد شده و شناسایی شده بودند.

این نتیجه با توجه به این بدست آمد که این فرآورده­ها پس از تحویل و بدون استفاده به TVC بالای حد مجاز رسیده بودند که نشان می­دهد فرآورده­هایی که در منزل مصرف می­شوند وضع بسیار بدتری دارند و در واقع آلودگی آنها در حین مصرف افزایش می­یابد در حالیکه در ابتدا TVC قابل قبولی داشته­اند.

از نکات بالا می­توان اینگونه نتیجه گرفت که فرآورده نیاز به یک نوع محافظ دارد تا جلوی رشد و افزایش تعداد میکروب­ها را بگیرد.

* نکات دیگری مثل طریقه مصرف و طریقه بسته­بندی نیز بر بار میکروبی فرآورده تأثیرگذارند که در جلسات بعد به آنها خواهیم پرداخت.