روش رنگ امیزی اسید فاست – روش زیل نیلسون
اسید فاست بمعنای مقاومت در مقابل رنگ بری با یک رنگ بر اسیدی می باشد. این خاصیت در باکتریها بسیار نادر است و فقط باکتریهای جنس مایکوباکتریوم و بعضی گونه های جنس نوکاردیا ، اسید فاست هستند. استافیلوکوکوس اپیدرمیس را هم می توان جزء باکتریهای اسید فاست دانست.
بطور کلی در دیواره سلولی باکتریهای اسید فاست مقدار چربی بسیار زیاد است (خصوصا در مایکوباکتریومها) و آنها مقادیر نسبتا زیادی مواد چربی ، مثل اسیدهای چرب ، مومها و چربیهای پیچیده دارند. دیواره سلولی این ارگانیسمها شبیه موم بوده بنابراین نسبتا غیر قابل نفوذ هستند. این نفوذ ناپذیری در برابر مواد ضد عفونی کننده هم به این باکتریها مقاومت بیش از حدی می دهد. همچنین آنها را در برابر خشک شدن مقاوم می کند و برای مدتهای طولانی می توانند در خلط یا دیگر مایعات خشک شده بدن باقی بمانند. ولی باسیل سل توسط پاستوریزاسیون و سترون سازی عادی توسط حرارت با آسانی از بین می رود.
دراین رنگ آمیزی بخاطر وجود دیواره سلولی نفوذ ناپذیر مومی ، برای نفوذ دادن رنگ اولیه که کربول فوشین می باشد انجام اقدامات ویزه ای ضروری میباشد. رنگ اولیه همراه با فنل 5% مایع (اسید کربولیک) تهیه می شود تا نفوذ با یاخته تشدید شود. حرارت هم بعنوان یک عامل نفوذ دهنده در اینجا بکار می رود . همینکه رنگ به دیواره سلولی نفوذ کرد ، سلول باکتری بخاطر خاصیت اسید فاست بودن ، علی رغم بکار بردن رنگ برهای قوی رنگ خود را حفظ می کند . سلولها اسید فاست رنگ اولیه را حفظ می کنند و در زیر میکروسکوپ برنگ قرمز دیده می شوند . در صورتیکه میکروبهای غیر اسد فاست رنگ ثانویه را جذب کرده و به رنگ آبی در می آیند.
روش رنگ آمیزی اسید فاست :
1- ابتدا یک گسترش از باکتری روی لام تهیه کنید.
2- بعد از طی کردن مراحل تثبیت با حرارت ، سطح لام را با رنگ کربول فوشین آغشته کنید.
3- لام را حرارت دهید تا رنگ تبخیر شود(شعله را وارونه کنید و از روی رنگ بطور مکرر عبور دهید ) با شروع تبخیر رنگ از روی لام دوباره شعله را از روی رنگ عبور دهید و بعد آنرا دور کنید و اجازه ندهید رنگ بجوشد یا گستره خشک شود . به موازات تبخیر رنگ از روی لام ، کربول فوشین بیشتری به آن اضافه کنید. این عمل باید 5 دقیقه ادامه یابد.
4- لام را سرد کنید بعد شستشو دهید تا نشکند.
5- لام را کج کنید تا رنگ اضافه خارج شود و بعد آنرا بشوئید.
6- سطح لام را با اسید- الکل آغشته کنید. ماده رنگ بر در این رنگ آمیزی HCL 3% در اتانول 95% است که این اسید الکل یک رنگ بر بسیار قوی است و بگذارید 15 تا 30 ثانیه بماند . لام را با زاویه 45 درجه نگهدارید و محلول رنگ بر را قطره قطره روی آن بریزید . اگر خروج رنگ قرمز با محلول رنگ بر ادامه یافت دوباره لام را با اسید الکل آغشته کنید . زمانی که دیگر رنگ قرمز خارج نشد مرحله بعدی را انجام دهید . معمولا رنگبری کامل مایکوباکتریوم مشکل است .
7- لام را شستشو دهید .
8- سطح لام را با آبی متیلن لوفلر (رنگ ثانویه) آغشته کنید و بگذارید 1 دقیقه بماند.
9- رنگ را خالی کرده و لام را بشوئید.
10- لام را با کاغذ خشک کن به آرامی خشک کنید یا بگذارید در حالت زاویه دار در مجاورت هوا خشک شود.
گسترش را میکروسکوپ و روغن سدر بررسی کنید.
طرز تهیه رنگها و محلولها :
- کربول فوشین
فوشین بازی 3/. گرم
اتانول 95% 10سی سی
فنل متبلور 5 گرم
آب مقطر 95 سی سی
فوشین را در اتانول حل کنید . در ظرف دیگر بلورهای فنل را در آب حل کنید بعد دو محلول را با هم کاملا مخلوط کنید.
- رنگ بر اسید – الکل
اسید HCL 37% 3 سی سی
اتانول 95% 97 سی سی
اسید را به اتانول اضافه کرده و خوب مخلوط کنید.
- آبی متیلن لوفلر
آبی متیلن 3/.گرم
اتانول 95% 30 سی سی
آب مقطر 100 سی سی
ابتدا آبی متیلن را در اتانول حل کنید . بعد آب مقطر را اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . در پایان محلول را با استفاده از کاغذ صافی و قیف صاف کنید.
روش رنگ امیزی کپسول
بعضی از باکتریها ماده لزجی از خود ترشح می کنند که خارج از سلول و پیرامون آن جمع می شود و دیواره سلولی را می پوشاند . این لایه کپسول نامیده می شود که ضخامتهای متفاوت و چسبندگی متغیر دارد. اندازه کپسول به محیط کشت میکروبی بستگی دارد و همچنین باکتریهای بیماریزا ، در بین باکتریهای تولید کننده کپسول ، کپسولهای بزرگتری دارند. جنس این کپسول از پلی ساکارید است که در آب محلول و غیر یونی است .
کاربرد کپسول در باکتریها :
کپسول بعنوان یک سد اسمزی بین باکتری و محیط اطراف آن عمل می کند و در واقع نقش حفاظتی دارد. کپسول مانع از عمل بیگانه خواری گلبولهای سفید می شود همچنین بعنوان مخزن ذخیره مواد غذایی یا دفع مواد زائد هم می تواند عمل کند.
در تعدادی از باکتریهای بیماریزا ، وجود کپسول شدت بیماریزایی و عفونت زایی را افزایش می دهد و ممکن است حتی این بیماریزایی به وجود کپسول بستگی داشته باشد . مثلا در استرپتوکوکوس پنومونیا اگر توانایی تولید کپسول در باکتری از بین برود این باکتری غیر بیماریزا می شود.
در عمل رنگ آمیزی شرط رنگ گیری یک سلول یونی بودن آن می باشد یعنی وقتی سلول حالت یونی داشته باشد هنگام رنگ آمیزی بین نواحی یونیزه سطح سلول و اجزای یونیزه مولکولهای رنگ پیوند بوجود می آید . در نتیجه بین بارهای مخالف موجود در سطح سلول و مولکولهای رنگ پیوند یونی تشکیل می شود و باکتری رنگ می گیرد . اما چون کپسول را بعلت غیر یونی بودن آن نمی توان رنگ آمیزی کرد در نتیجه برای دیدن آن در زیر میکروسکوپ ، زمینه باکتری رنگ آمیزی می شود و در نتیجه امکان دیدن کپسول باکتری که بصورت بیرنگ ظاهر می شود ، فراهم می شود. این روش را رنگ آمیزی منفی می نامند.
در این روش رنگ آمیزی برای تثبیت گسترش از حرارت استفاده نمی شود . چون در اثر حرارت ، باکتری در داخل کپسول از شکل طبیعی خود خارج می شود.
روش کار در رنگ آمیزی کپسول :
1- روی یک لام تمیز بمقدار مساوی از مرکب چینی و سرم فیزیولوژی را با هم مخلوط کرده و با لوپ (نوک آنس) مقدار کمی از کشت باکتری را به آن اضافه کنید ، سوسپانسیون را به آرامی و کاملا مخلوط کنید و گسترش را پخش کنید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود.
1- سطح گسترش را با آبی متیلن لوفلر بپوشانید و بگذارید 3 دقیقه بماند . بعد رنگ اضافی را خالی کرده و بعد با آب مقطر آنرا شستشو دهید. در این هنگام ممکن است مقداری از گسترش نیز شسته شود و این جای نگرانی ندارد چون گسترش ضخیم است و حتما مقداری از آن برای مطالعه شما باقی می ماند.
2- لام را با زاویه 45 درجه نگدارید و بگذارید در مجاورت هوا خشک شود . توجه داشته باشید که هیچگاه کاغذ خشک کن را روی آن نکشید.
اگر محیط مایع بود استفاده از سرم فیزیولوژی ضروری نیست .
هنگام مخلوط کردن کشت با مایع به آرامی هم بزنید تا آرایش باکتریها بهم نخورد.
طرز تهیه رنگها و محلولها :
1- آبی متیلن لوفلر
- آبی متیلن 3/.گرم
- اتانول95% 30سی سی
- آب مقطر 100سی سی
رنگ را در اتانول حل کنید . آب مقطر را به آن اضافه کرده و خوب مخلوط کنید . محلول را با استفاده از قیف از کاغذ صافی عبور دهید.
2- سرم فیزیولوژی
- کلرور سدیم 85/.گرم
- آب مقطر 100سی سی
کلرور سدیم را در آب مقطر حل کنید