گزارش کار آزمایشگاه ژنتیک 2

شامل :

گزارش استخراج  RNAو DNA

استخراج DNA  پلاسمیدی

PCR

محلول سازی

الکتروفورز

 در ادامه مطلب مشاهده نمایید

 ویا از لینک دانلود نمایید(عکس ها هم در فایل لینک میتوانید مشاهده کنید

http://s3.picofile.com/file/7596150428/%DA%AF%D8%B2%D8%A7%D8%B1%D8%B4_%D8%A7%D8%B3%D8%AA%D8%AE%D8%B1%D8%A7%D8%AC_RNA.docx.html

آزمایشگاه ژنتیک 2

 گزارش استخراج  RNAو DNA

استخراج DNA  پلاسمیدی

PCR

محلول سازی

الکتروفورز

کاری از:

 علی عزلتی مقدم

استاد نوشین مهندسی

دانشگاه آزاد تهران مرکزی

استخراج RNA و DNA

استخراجRNA  با کمیت و کیفیت مناسب جهتreverse transcriptas PCR ، هیبریدیزاسیون در نورترن بلاتینگ و آنالیز بیان ژن با Real Time PCR از اهمیت بسیاری برخوردار است

 استخراج RNA یکی از مراحل اساسی در اکثر تحقیقات انجام شده در زمینه miRNA است. روشهای متفاوتی برای استخراج RNA تام وجود دارد اما فقط برخی از آنها می توانند RNA های کوچک مولکول را حفظ کرده و استخراج نمایند

بدین منظور از نمونه مغز استخوان بدلیل غلظت بالای محتویات سلولی استفاده میشود

از محلول های tripure برای خارج کردن محتویات سلولی (به نسبت 1 به 3 با فنول و گوانیدین) و فنول برای ته نشین کردن پروتین ها و گوانیدین سیانات به منظور غیر فعال کردن DNase و Rnase استفاده میکنیم

برای استخراج باید پروتین ها و لیپید ها را حذف کرده و در نهایت RNA DNA  داشته باشیم

سانتریفیوژ در دمای 4 درجه سانتیگراد باید انجام شود تا RNA تچجزیه نشود

ابتدا 200 میلی لیتر از نمونه را با 600 میلی لیتر tripure و سپس 200 میلی لیتر کلروفرم اضافه کرده و تکان میدهیم به مدت 10 دقیقه در محیط میماند تا مواد روی سلول اثر کند

از اینجای کار باید همه چیز استریل باشد و غیر استریل روی استخراج اثر منفی خواهد داشت

سپس سانتیریفیوژ به مدت ده دقیقه و دمای چهار درجه و 12000g

در تیوب سه لایه خواهیم دید

لایه اول که در بالا قرار گرفته همان RNA DNA

لایه دوم که رنگ سفید دارد پروتین های سلولی اند که رسوب داده اند

لایه زیرین و سوم اندامک ها و محتویات سلولی اند

برای از بین بردن پروتین ها از پروتاز و فنول و کلروفرم استفاده میشود و اگر بافت بود پرتاز هم در ایسنجا استفاده میکردیم

لایه اول و رویی را برداشته و با Dnase به مقدار کم 2-200 ماکرولیتر مخلوط کرده و سپس 5 دقیقه با شرایطی که بالا هم سانتریفیوژ کردیم مجددا اینکار را انجام میدهیم در صورتیکه DNA میخواستیم استخراج کنیم در این مرحله Rnase  میزنیم و باقی مراحل مشابه خواهد بود

حالا لایه رویی RNA  و لایه زیر DNA

RNA را برداشته و با 500 میلی لیتر ایزوپروپانول بدون ناخالصی (الکل 100%) مخلوط کرده و آرام تکان میدهیم که RNA شکسته نداشته باشیم بعد از 5 دقیقه در محیط ماندن سانتریفیوژ 12000g و 5 دقیق و 4 درجه

اینبار رسوب را برمیداریم و سوپرناتانت را دور میریزیم بازم با الکل شستشو بیشتر و خالص سازی و جدا کردن املاح را انجام میدهیم و متانول 75% حدود 500 ماکرو لیتر تا حدی که رسوب در اتانول شناور شود تا سه بار هم میشود شستشو را انجام داد

در پایان بافر TE و یا آب نکلاز فری به میزان 30 M اضافه میکنیم به رسوب RNA

برای نگه داری کوتاه مدت در دمای منفی 20 و مدت طولانی در دمای منفی 70 میتوان نگه داری کرد

استخراج DNA پلاسمیدی و جداسازی DNA پلاسمیدی و کروزمی

پلاسمید مولکول DNA کوچکی است که بطور مجزا از کروموزوم در سلول وجود دارد. همانند سازی پلاسمیدها در سیتوپلاسم و بطورمستقل از ژنوفور انجام می‌گیرد. پلاسمیدها معمولاً به شکل یک مولکول DNA دورشته‌ای حلقوی هستند (هرچند انواع خطی پلاسمید نیز وجود دارد). هر پلاسمید دارای یک محل آغاز همانند سازی (ori) است که همانند سازی پلاسمید از آن نقطه شروع می‌شود.

چرا DNA پلاسمیدی انقدر برای ما مهمه که باید خالص شود؟؟؟

وکتورها

وکتورها، پلاسمیدهایی هستند که در مهندسی ژنتیک از آن‌ها استفاده می‌شود. از پلاسمیدها در مهندسی ژنتیک برای تکثیر یا بیان ژن یا ژن‌های خاصی استفاده می‌شود. برای این کار، ژن مورد نظر را وارد پلامسید می‌کنند. این نوع از پلاسمیدها بطور معمول دارای یک ژن مقاومت آنتی بیوتیکی (برای غربالگری) و یک جایگاه کلونینگ چندگانه یا polylinker است. جایگاه کلونینگ چندگانه، قطعه کوچکی از پلاسمید است که دارای چند جایگاه برش برای آنزیم‌های محدودالاثر مختلف است. این کار سبب می‌شود که قطعه یا ژن دلخواه به راحتی وارد پلاسمید شود. در مرحله بعد، پلاسمید از طریق ترانسفورماسیون وارد باکتری می‌شود. سپس باکتری در معرض یک آنتی بیوتیک خاص قرار می‌گیرد. باکتری‌هایی که پلاسمید مورد نظر را داشته باشند، زنده می‌مانند زیرا ژن مقاومت آنتی بیوتیکی را بر روی پلاسمید مورد نظر حمل می‌کنند اما باکتری‌هایی که پلاسمید را نداشته باشند، می‌میرند. با استفاده از این روش (غربالگری با آنتی بیوتیک) می‌توان باکتری‌های دارای پلاسمید را جدا ساخت و آن‌ها را به میزان زیاد تکثیر داد. سپس پلاسمیدها را به میزان زیاد از آن‌ها جدا ساخت. ظرفیت پذیرش قطعات DNA در پلاسمیدها بین ۱ تا ۱۰ کیلو جفت باز است. برای کلون کردن قطعات یا ژن‌های بزرگتر بایستی از فاژ لامبدا، کاسمیدهاکروموزوم‌های مصنوعی باکتریایی یا کروموزوم‌های مصنوعی مخمری استفاده کرد.

مدل‌های بیماری

دانشمندان از دیرباز با استفاده از پلاسمیدها، سلوهای بنیادی جنینی موش‌ها را تغییر می‌دادند تا بیماری‌های ژنتیکی را مدل‌سازی کنند. البته این امر با محدودیت‌هایی روبرو بود که کاربرد گسترده تر آن در انسان را با چالش روبرو می‌ساخت. با این حال، پیشرفت در زمینه تکنیک‌های نوترکیبی در ویروس‌های مرتبط با آدنو (به انگلیسی: Adeno-associated virus) و نوکلئازهای انگشت روی در ایجاد مدل‌های بیماری‌های ژنتیکی انسانی بسیار مؤثر بوده‌اند.

ژن درمانی

موفقیت ژن درمانی بستگی به داخل سازی ژن دلخواه به درون کروموزوم انسان بدون ایجاد آسیب به سلول، ایجاد جهش‌های سرطان زا یا پاسخ ایمنی داشته‌است. استفاده از وکتورهای پلاسمیدی، یکی از روش‌های ژن درمانی است. استفاده از نوکلئازهای انگشت روی موجب نوترکیبی هومولوگ در جایگاه خاصی از کروموزوم می‌شود. از این طریق می‌توان ژن دلخواه را وارد سلول‌های انسانی کرد.

جدا سازی بر اساس اندازه: اگر سلول تحت شرایط کاملاً کنترل شده تخریب گردد و تنها مقدار کمی از DNA کروموزومی شکسته خواهدشد و قطعات DNA حاصل هنوز آنقدر نسبت به پلاسمیدها بزرگ هستند که می توان با انجام سانتریفیوژآنها با سایر قسمت های سلول رسوب داد این پدیده در سایۀ اتصال فیزیکی کروموزوم باکتری به غشا سلولی صورت می پذیرد بنابر این تخریب سلول باید به آرامی انجام شود تا منجر به ایجاد شکستگی کاملDNA کروموزومی باکتری نشود.اگر در E.Coliتیمار سلول با EDTA ولیزوزیم در حضور ساکاروز انجام می شود تا از تخریب مستقیم سلولی جلوگیری شود و اسفروبلاست شکل گیرد در این حالت با افزودن مواد پاک کنند مانند ترتیون- ایکس 100 (پاک کننده های یونی مانند SDS موجب شکستن کروموزوم می گردند) تخریب سلولی انجام می شود در این روش شکست DNA کروموزومی باکتری در حد بسیار نا چیز است بنا بر این بعد از انجام سانتریفیوژ در مایع رویی که DNA پلاسمیدی قرار می گیرد وجود مقدار کمی از DNA کروموزومی در شیره سلول شفاف رویی اجتناب ناپذیر است. خصوصاً اگر پلاسمیدها اندازه بزرگی داشته باشندممکن است همراه با اجساد رسوب کنند بنابر این ،این روش به تنهایی کافی نخواهد بود وباید راههای دیگری برای جدا کردن DNA پلاسمیدی از DNA کروموزومی وجود داشته باشد.

جدا سازی بر اساس شکل فضایی: برای توضیح این روش اول باید ساختار فضایی پلاسمیدهای حلقوی توجه شود DNA های حلقوی یا به صورت ابرمارپیچی هستند یا به صورت حلقۀباز.

 بیشتر پلاسمید های موجود در سلول به صورت ابرمارپیچ(Supercoil ) هستند.ابر مارپیچ در طی همانند سازی نسبتاًپیچش خود را توسط آنزیم توپوایزومرازاز دست می دهد.

ساختار فضایی ابر مارپیچ تنها در صورتی که دو رشته پلی نوکلئوتیدی به صورت دست نخورده باشند می تواند با قی بماند بنا بر این بنام حلقه بسته کووالانسی (CCC ) خوانده می شود و اگر یکی از رشته های پلی نوکلئوتیدی شکسته شود،مارپیچ دو تایی به شکل طبیعی یعنی حالت استراحت بر می گردد و به شکل فرم باز( OC) در می آید ساختار فضایی ابر مارپیچ برای تهیه پلاسمید اهمیت دارد چون مولکولهای ابر مارپیچ نسبتاً به آسانی ازشکل های غیر ابر مارپیچ قابل جدا سازی می باشند که برای این کار از دو روش استفاده می شود:

الف)جدا سازی رشته های DNA با استفاده از مواد قلیایی(الکالین دناتوراسیون) : اساس تکنیک بر این است که در ناحیۀ محدود جداسازی رشته های DNA ،DNA دارای ابرماپیچ بدون تغییر می ماند در حالی که دو رشته DNA فاقد ساختار ابر مارپیچ ازیکدیگر جدا می شوند اگرNaOH به شیره سلولی شفاف رویی اضافه شود به طوری که PH بین 5/12-12تنظیم شود پیوندهای هیدرونی در مولکول هایDNA که فاقد ابرمارپیچ هستند شکسته می شوند و مارپیچی دوتایی از هم باز شده و دو زنجیر پلی نوکلئوتیدی از هم جدا می شوند . اگر در این هنگام اسید افزوده شود این رشته های DNA باکتریابی از هم جدا به صورت یک توده در می آیند وآنهارا با سانتریفیوژمی توان جدا می کرد.در زیر و رسوب dnaکروموزمی و بالا پلاسمیدی میباشد.

یکی از مزایای این روش این است که در بعضی شرایط( به ویژه تجزیۀ سلولی به وسیلۀ SDS وخنثی سازی به وسیلۀ استات سدیم )بیشتر پروتئین ها و RNA به صورت غیر محلول در می آیند و می توانند به وسیلۀسانتریفیوژ حذف شوند در صورت انجام تجزیه به وسیلۀ آلکالین ممکن است به استخراج توسط فنل و یا تیمار توسط ریبونوکلئاز نیاز نباشد

Solution1:

Glc 50mmol/l

EDTA 25mmol از بین بردن دیواره

Tris25mmolبافر و نگه دارنده

Solution2:

NaoH 3molar

SDS10% از بین بردن غشاو لیپو پروتیین و پروتین های غشا

Solution3:

اسید اتیک 6سی سی

استات سدیم 12سی سی

اب مقطر 12 سی سی

ب) انجام سانتر یفیوژ بر اساس شیب چگالی ایتیدیوم برومایید-کلرید سزیم:

این روش حالت خاصی ازیک تکنیک معمولی سانتریفیوژ تعادلی با سانتریفیوژ درشیب چگالی است.

هنگام سانتر یفیوژ مولکول های بزرگتر موجود در محلول کلرید سزیم در نقطۀ معین به صورت باز ظاهر می شوند محل دقیق قرارگیری یک باند به چگالی تعلیق آن بستگی دارد چگالی تعلیقDNA حدود g/cm37/1است بنابراین در این شیب به محلی که غلظتg/cm3 ,CsCl 7/1است مهاجرت می کند در مقابل ، چگالی تعلیق مولکول های پروتئینی پایین تر است بنابراین در بالای لوله قرار می گیرند در حالی که RNA هابه صورت رسوبی درکف قرار می گیرند.

 این روش می تواند بجای استخراج DNA توسط فنل و تیمار ریبونوکلئاز مورداستفاده قرار گیردانجام سانتریفیوژ در شیب چگالی درحضور برمیداتیدیمEtBr که می تواند برای جدا کردنDNA ابرمارپیچ از مولکولهای غیر ابرمارپیچ به کار رود EtBr با قرار گرفتن در بین جفت بازهای مجاور واتصال به DNA باعث مارپیچ دوتایی می شود این عمل موجب کاهش چگالی تعلیق می گردد.(چگالی تعلیق DNA خطی g/cm3 125/0 است) از آنجا که DNA ابر مار پیچ فاقد پایانه های آزاد است آزادی کمتری برای باز شدن دارد و مقدار محدود EtBr به آن وصل می شود . بنابراین کاهش چگالی تعلیق یک مولکول ابر مار پیچ خیلی کمتر است و فقط حدود g/cm3 085/0 است در نتیجه ابر مارپیچ در شیب چگالی EtBr-CsCl درموقعیت های مختلف مربوط به فرم های خطی یا حلقوی باز قرار می گیرند.

این روش راه بسیار مؤثری برای استخراج پلاسمید خالص است ،زمانی که این روش به کار می رود باند پلاسمیدی در نقطۀ مجزایی نسبت به DNA خطی باکتری قرارمی گیرند،وپروتئین های شناوردر سطح می باشند و رسوب RNA در کف لوله قرار می گیرد موقعیت باند های DNA با تابش نور ماوراء بنفش به لوله که مو جب ایجاد فلورانس در EtBr اتصالی به DNA می گردد مشخص می شود و DNA خالص پلاسمید ی توسط سرنگ مخصوص جمع آوری می شود وEtBr متصل به DNA پلاسمیدی توسط –n بوتانل استخراج می گرددو با انجام دیالیزکلرید سزم نیز حذف می شود

Etbr باعث میشه وقتی فراپیچش کم باشه ساختار زودتر باز میشه و میزان چگالی شناوری آن کمتر میشو چون ساختارش باز شده و کمی بالاتر می ایستد

Polymerase Chain Reaction

واکنش زنجیرهٔ پلیمراز (به انگلیسی: Polymerase Chain Reaction) که مخفف آن (PCR) می‌باشد. بطور کلی «واکنش زنجیره پلیمراز» به روش ازدیاد مقادیر جزئی DNA یا RNA تا حد مشاهدهٔ آنها توسط روش‌های ساده و رایج آزمایشگاهی اطلاق می‌شود. قابلیت «پی سی آر» در ازدیاد اسیدهای نوکلئیک موجود در نمونه مورد آزمایش موجب شناسایی سریع و اختصاصی نوع سلول یا میکروارگانیسم مورد نظر در نمونه مذکور می‌گردد که این ویژگی علاوه بر بکارگیری «پی سی آر» در تشخیص آزمایشگاهی بیماریها و شناسایی انواع سلولها، آن را به عنوان ابزاری مطمئن و حساس در زمینه پژوهش‌های علمی مطرح می‌سازد.

از کاربردهای پی سی آر می‌توان به کاربرد آن در بررسی حذفهای کروموزومی مشخص، تکثیر DNA برای تعیین توالی ، تشخیص بیماری های وراثتی و یا شناسای اثر انگشت ژنتیکی (برای استفاده در پزشکی قانونی و یا یافتن نسبت های خویشاوندی) و یا آشکار سازی و تشخیص بیماری های عفونی ،بررسی جهش های مشخص، بررسی وجود ویروس ها در نمونه اشاره کرد که از مهمترین ویروس هایی که توسط این روش مورد بررسی قرار میکیرند می‌توان از HIV ،HCV نام برد.

پی سی آر یک تکنیک بسیار ساده و کار آمد در تکثیر قطعه ای از دی ان آ میباشد، البته قطعه ای مشخص. برای تکثیر دd ان آ توسط پی سی آر میبایست ابتدا در دو طرف قطعه مورد نظر که قطعه هدف نامیده میشود پرایمر هایی را طراحی کرد که مکمل توالیهای دو طرف توالی هدف باشند سپس توسط آنزیمهای پلیمراز میتوان قطه ما بین پرایمرها را که در بین دو سوی 3 پریم پرایمرها قرار دارند را تکثیر کرد.

در طراحی پرایمر باید نکات خاصی در نظر گرفته شود مثلا حتما قسمت 3پریم از پرایمر میبایست مکمل بخش هدف باشد که این برای بخش 5 پریم الزامی نمیباشد همچنین باید در نظر گرفته شود که دو پرایمر حداقل توالی مکمل یکدیگر را داشته باشند و توالی های مستعد تشکیل سنجاق سری هم در آنها تا حد معمول استفاده نشود.

انزیم همانندسازی پلیمراز میباشد

شریط invivoرا درشرایط اژمایشگاه شبیه سازی میکنیم

مرحله اول: واسرشت سازی (Denaturation)، 30 تا 60 ثانیه

عمل انجام شده در این مرحله: جدا شدن دو رشته DNAدر 95 درجه سانتیگراد

مرحله دوم: اتصال پرایمر Annealing 30 تا 60 ثانیه در 60 درجه سانتی گراد

عمل انجام شده در این مرحله: اتصال پرایمرها به نواحی مکمل روی DNA و تعیین محدوده تکثیر قطعه DNA

مرحله سوم: گسترش (Extension یا Elongation)، به ازای هر 1000 نوکلئوتید طول قطعه 60 ثانیه

عمل انجام شده در این مرحله: تکثیر قطعه DNA مورد نظر 72 درجه سانتی گراد

این 3 مرحله بین 25 تا 40 بار تکرار می شود که به آن چرخه های PCR می گویند.

در یک واکنش PCR از نمونه DNA، آنزیم Taq polymerase، پرایمرها، بافر، یون منیزیم، نوکلئوتیدها وdntp و آب حضور استفاده می شود. توضیحات مربوط به هر یک از این اجزا در ادامه ارائه شده است:

دمای اتصال را یکی دو درجه زیر tmد ان ا میگذاریم

Tm=4(G+C)+2(A+T)

باید تعدا گوانین و سیتوزین به مقدار 40-60% باشد

- نمونه DNA (الگو)

تکثیر از روی نمونه DNA انجام می شود. این نمونه می تواند، قطعه ای DNA، محصول استخراج DNA ژنومی، DNA پلاسمیدی یا حتی محصول PCR دیگری باشد. معمولاً حدود یک نانوگرم از DNA پلاسمیدی یا فاژی یا یک میکروگرم از DNA ژنومی برای یک واکنش PCR کافی است. بیش از این مقدار، باعث تولید محصولات غیر اختصاصی (قطعات DNA دیگری غیر از قطعه مورد نظر) شده و مقدار کم نمونه DNA نیز باعث کاهش دقت واکنش PCR یا عدم تکثیر قطعه مورد نظر می گردد. کیفیت نمونه DNA نیز مهم است به طوری که باقی ماندن ترکیبات مورد استفاده در مرحله استخراج DNA مثل فنل و EDTA، باعث کاهش فعالیت آنزیم Taq polymerase و عدم حصول نتیجه مورد نظر می گردد. همچنین آلوده شدن واکنش PCR با مقادیر بسیار اندک DNA از هر منبع دیگری، به دلیل حساسیت فوق العاده این تکنیک، ممکن است به تولید قطعات غیر قابل انتظار بیانجامد.

- آنزیم Taq polymerase

این آنزیم برای تکثیر قطعات کمتر از سه هزار جفت باز توصیه شده و پر مصرف ترین آنزیم مورد استفاده در PCR می باشد. به طور معمول حدود یک واحد از این آنزیم در 50 میکرو لیتر از واکنش PCR استفاده می شود. اگر نمونه DNA حاوی مواد ممانعت کننده PCR باشد، می توان این مقدار را دو تا سه برابر افزایش داد ولی مقادیر بالاتر آنزیم باعث تولید محصولات غیر اختصاصی می گردد. گرچه دمای مناسب برای این آنزیم 72 درجه سلسیوس می باشد ولی چون این آنزیم در دمای معمولی نیز قادر به تکثیر می باشد برای جلوگیری از اتصال قطعات پرایمر به نقاط دیگری روی توالی نمونه DNA و امکان تولید قطعات غیر اختصاصی، توصیه می شود که تمامی مراحل آماده سازی واکنش PCR بر روی یخ صورت گیرد.

- نوکلئوتید ها

چهار نوکلئوتید تشکیل دهنده قطعه DNA از اجزا واکنش PCR می باشند که به عنوان واحد های ساختمانی مورد نیاز در ساخت قطعه DNA استفاده می شوند. غلظت مورد نیاز از هر یک از نوکلئوتیدها برای واکنش PCR یکسان و برابر 200 نانو مولار می باشد. برای این منظور از مخلوط های آماده واجد هر چهار نوکلئوتید که با غلظت های مختلف مثل دو میلی مولار، 10 میلی مولار و 25 میلی مولار موجود است، استفاده می شود. به طور مثال، در یک واکنش 50 میکرو لیتری PCR باید 5 میکرو لیتر از مخلوط دو میلی مولار نوکلئوتیدها برای دستیابی به مقدار مورد نیاز در واکنش استفاده کرد.

- بافر

مهمترین نقش بافر PCR تنظیم pH مناسب واکنش PCR و آنزیم Taq polymerase می باشد. اجزای این بافر نقش های دیگری نیز دارند از جمله کلرید پتاسیم که به اتصال پرایمر به DNA الگو (نمونه) کمک می کند.

- پرایمرها

غلظت بهینه پرایمرها برای واکنش PCR از 100 نانو مولار تا یک میکرو مولار متغییر است. غلظت بیش از این، منجر به تولید قطعات غیر اختصاصی می شود. طراحی پرایمر نیازمند دقت فراوانی است و مرحله بسیار مهمی در امکان پذیر شدن و صحت تکثیر قطعه مورد نظر دارد. دمای مرحله اتصال در برنامه PCR به توالی پرایمرها ارتباط دارد.

پرایمر ما باید اختصاصی برای د ان ا الگو باشد

توالی پرامیر f وr مکمل هم نباشند

توالی پرایمر تشکیل لوپ ندهد

وسایل مورد نیاز برای واکنش PCR

حداقل وسایل مورد نیاز برای انجام واکنش PCR، دستگاه ترموسایکلر (ایجاد کننده چرخه های دمایی)، میکرو پیپت، ظرف یخ و وسایل یکبار مصرفی مانند تیپ (جز پلاستیکی که برای کشیدن محلول به میکرو پیپت متصل می شود) و ویال (لوله های درب دار کوچک، در دو اندازه بر اساس گنجایش آنها یعنی 200 و 500 میکرو لیتر، که واکنش PCR در آنها انجام می شود) و ظروف نگهداری آنها می باشد.

دستگاه ترموسایکلر برای ایجاد دماهای مختلف در مدت زمان مورد نظر، قابل برنامه ریزی می باشد. قبل از تولید این دستگاه، دانشمندان برای انجام PCR از سه حمام آب گرم با دماهای مختلف استفاده می کردند که کار بسیار پر زحمتی بود.

میکرو پیپت برای برداشتن مقادیر اندک مورد نیاز برای واکنش PCR در مقیاس میکرو لیتر استفاده می شود. بر روی این دستگاه که کار کردن با آن بسیار راحت است، تیپ های یک بار مصرف قرار داده می شود و بدین وسیله حجم مورد نظر از آن برداشته و به واکنش PCR افزوده می شود.

بعد از مدتی آنزیم خسته میشود و به همین دلیل بازده پی سی ار را تا 50% هم قبول دارند و برای اطلاع از نتیجه کار و بررسی محصول میتوان اعمال زیر را انجام داد

الکتروفورز-از پهنای باند و میزان باند و جایگاه ان میفهمیم

توالی یابی با sequencing

کلونیگ و بیان cloning and expresion